Un mecanismo epigenético desde hace más de

Molecular Psychiatry volumen 27, páginas 4893–4904 (2022)Cite este artículo

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El miedo excesivo es una característica distintiva de los trastornos de ansiedad, una de las principales causas de carga de morbilidad en todo el mundo. Existe evidencia sustancial que respalda el papel de los circuitos de la corteza prefrontal y la amígdala en la regulación del miedo y la ansiedad, pero los mecanismos moleculares que regulan su actividad siguen siendo poco conocidos. Aquí, mostramos que la regulación negativa de la histona metiltransferasa PRDM2 en la corteza prefrontal dorsomedial mejora la expresión del miedo al modular la consolidación de la memoria del miedo. Además, mostramos que la eliminación de Prdm2 (KD) en las neuronas que se proyectan desde la corteza prefrontal dorsomedial a la amígdala basolateral (dmPFC-BLA) promueve una mayor expresión del miedo. Prdm2 KD en el circuito dmPFC-BLA también resultó en una mayor expresión de genes implicados en la sinaptogénesis, lo que sugiere que Prdm2 KD modula la consolidación del miedo condicionado modificando la fuerza sináptica en los objetivos de proyección de dmPFC-BLA. De acuerdo con una eficacia sináptica mejorada, encontramos que dmPFC Prdm2 KD aumentó la probabilidad de liberación glutamatérgica en BLA y aumentó la actividad de las neuronas BLA en respuesta a señales asociadas al miedo. En conjunto, nuestros hallazgos proporcionan un nuevo mecanismo molecular para las respuestas de miedo excesivo, en el que PRDM2 modula el circuito dmPFC-BLA a través de cambios transcriptómicos específicos.

El miedo normal provoca respuestas adaptativas destinadas a escapar de eventos que amenazan la vida [1, 2]. Por el contrario, las respuestas de miedo excesivo se vuelven desadaptativas y son características de los trastornos relacionados con el miedo, como el trastorno de estrés postraumático y varios trastornos de ansiedad [3]. La patología de los procesos de memoria involucrados en el miedo aprendido puede conducir a respuestas conductuales amplificadas que no logran extinguirse a pesar de la ausencia de una amenaza relevante [4]. La identificación de los circuitos neuronales y los mecanismos moleculares que subyacen a la memoria excesiva del miedo puede identificar vías moleculares a las que pueden dirigirse los tratamientos mecanicistas.

La investigación que utiliza el condicionamiento del miedo ha identificado estructuras cerebrales involucradas en el procesamiento de la memoria del miedo [5, 6]. Entre ellos, el complejo de la amígdala, que incluye la amígdala central (CeA) y la amígdala basolateral (BLA), es fundamental para el condicionamiento del miedo pavloviano [7]. El CeA participa en la expresión de respuestas de miedo condicionadas, mientras que el BLA actúa como un sitio primario donde se forman y almacenan asociaciones entre estímulos condicionados e incondicionados [8]. La amígdala está ampliamente interconectada con la corteza prefrontal (PFC), una región del cerebro importante para la regulación de las emociones [9]. También se cree que la CPF, incluida la corteza prefrontal dorsomedial (dmPFC; corteza prelímbica y cingulada) y la corteza prefrontal ventromedial (infralímbica), participa en el procesamiento de la memoria del miedo [10, 11]. En particular, la activación de proyecciones desde dmPFC a BLA se ha asociado con una regulación de arriba hacia abajo de la expresión del miedo [12,13,14,15]. Sin embargo, los mecanismos moleculares que regulan la modulación de la vía dmPFC-BLA del procesamiento de la memoria del miedo aún no se han comprendido completamente.

Cada vez hay más evidencia que apunta a un papel de los mecanismos epigenéticos en la regulación de los procesos de memoria del miedo [16, 17]. Las experiencias pasadas, incluidos eventos estresantes, pueden conducir a un "proceso de reprogramación" a través de cambios en la expresión genética. Se cree que la regulación epigenética es un mecanismo clave que altera la transcripción y la traducción [18] de manera dependiente de la experiencia [19,20,21]. Por lo tanto, las amplias desregulaciones de la expresión genética mediadas por procesos epigenéticos pueden vincular la exposición al estrés traumático con el desarrollo de trastornos relacionados con el estrés.

Anteriormente descubrimos que la regulación negativa de la histona metiltransferasa PR que contiene el dominio 2 (PRDM2), por antecedentes de dependencia del alcohol, se asociaba con un aumento de las respuestas al estrés. PRDM2 promueve el silenciamiento de genes mediante la adición de un grupo metilo en la histona H3 lisina 9 [22]. PRDM2 está fuertemente enriquecido en el cerebro y se expresa selectivamente en neuronas de dmPFC, lo que sugiere un papel de esta enzima epigenética en la función neuronal [23]. En consecuencia, encontramos que la eliminación de Prdm2 (KD) en el dmPFC potenció la recaída en la búsqueda de alcohol inducida por el estrés [23]. Una creciente literatura indica un vínculo entre el consumo excesivo de alcohol y los trastornos relacionados con el miedo tanto a nivel conductual como neuronal [24,25,26,27,28]. Por lo tanto, aquí planteamos la hipótesis de que la deficiencia de Prdm2 en el dmPFC puede contribuir al desarrollo del miedo patológico al promover cambios en la expresión genética en los circuitos cerebrales relacionados con el miedo.

Para probar esta hipótesis, derribamos Prdm2 en la dmPFC de rata y evaluamos los efectos sobre la adquisición, expresión y extinción del miedo condicionado. Dado el papel fundamental de las proyecciones de dmPFC al BLA en el miedo condicionado [12, 13, 29, 30], a continuación utilizamos una estrategia específica de proyección para determinar si Prdm2 KD regula el miedo a través de esta vía neuronal. Luego utilizamos la purificación por afinidad ribosomal de traducción viral (vTRAP) con secuenciación de ARN de alto rendimiento (RNAseq) para identificar las consecuencias moleculares posteriores de Prdm2 KD de una manera específica del circuito. Debido a que este análisis identificó una amplia regulación positiva de las transcripciones que codifican proteínas involucradas en la regulación de la actividad sináptica, finalmente investigamos los efectos de Prdm2 KD en las entradas glutamatérgicas al BLA utilizando grabaciones de parche en cortes de amígdala y medimos la actividad de las neuronas dmPFC-BLA durante Prueba de memoria del miedo con fotometría de fibra in vivo.

Se alojaron ratas Wistar macho adultas (200–225 g, Charles River, Alemania) bajo un ciclo de luz inverso con comida y agua ilimitadas. Los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Comité Nacional para la investigación con animales en Suecia y fueron aprobados por el Comité de Ética Local para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Linköping.

En este estudio se utilizaron nueve lotes de ratas (N = 268). La agrupación de animales se asignó al azar. En el experimento 1 (n = 17 codificados y 20 Prdm2 KD), se evaluó la adquisición, expresión (después de 24 h) y extinción de la memoria del miedo en ratas. En el experimento 2 (revuelto: n = 12 y Prdm2 KD n = 12), se evaluó en ratas la expresión de la memoria del miedo 1 semana después del condicionamiento, así como la generalización del contexto y la sensibilidad al impacto en las patas. En el experimento 3 (n = 17 codificados y 20 Prdm2 KD), replicamos el efecto de Prdm2 KD que aumentó la expresión del miedo 24 h después del condicionamiento del miedo con señales. Antes de someterse al condicionamiento del miedo, se realizaron pruebas de ansiedad en el EPM y la actividad locomotora de las ratas. Los niveles de corticosterona en plasma se midieron al inicio del estudio, después del acondicionamiento y después de probar la expresión del recuerdo del miedo. Una semana después de la prueba de expresión del miedo, se sacrificaron las ratas y se recogió el dmPFC para el análisis de la expresión genética. En el experimento 4 (revuelto: n = 20 y Prdm2 KD n = 18), las ratas fueron condicionadas al estímulo de miedo 1 semana antes de la KD de Prdm2 mediada por virus y se probó la expresión de miedo un mes después de la cirugía. En el experimento 5 (codificado: n = 12 y Prdm2 KD n = 12), se probó el reconocimiento de objetos novedosos en ratas. En el experimento 6 (revuelto: n = 20 y Prdm2 KD n = 19), se investigaron los efectos de Prdm2 KD en neuronas que se proyectan específicamente al BLA sobre la expresión de la memoria de miedo 24 h después del condicionamiento. En el experimento 7 (revuelto: n = 18 ratas; grupos de 3 dmPFC y Prdm2 KD n = 18 ratas; grupos de 3 dmPFC), utilizamos vTRAP para analizar la expresión génica después de Prdm2 KD específicamente en las neuronas que se proyectan desde el dmPFC hasta el BLA. . En el experimento 8 (revueltos: n = 14 células de 5 ratas y Prdm2 KD n = 15 células de 6 ratas) utilizamos electrofisiología ex vivo para investigar cambios en la liberación de glutamato a las neuronas BLA después de Prdm2 KD. Finalmente, en el experimento 9 (codificado: n = 9 y Prdm2 KD n = 13) utilizamos fotometría de fibra in vivo para investigar más a fondo las consecuencias de Prdm2 KD en el BLA. En la figura complementaria S1 se ofrece una descripción general de los experimentos realizados en este estudio.

Durante el condicionamiento del miedo, las ratas fueron condicionadas en una cámara con señales visuales y odoríferas específicas y expuestas a seis pruebas de descargas en las patas de 2 s y 1 mA asociadas con un tono de señal neutro de 30 s (2,9 kHz, 80 dB; intervalo entre pruebas: 3 min; Med Associates Inc., St Albans, VT, EE. UU.). Se probaron las ratas para determinar la expresión de la memoria del miedo en una cámara con diferentes señales visuales y olfativas y se expusieron a tonos de señal de 6 × 30 s (consulte los métodos complementarios para obtener más detalles). La extinción se investigó repitiendo la prueba de expresión de miedo durante dos días más. La expresión del miedo se midió como % de tiempo pasado congelado durante el tono de 30 s por dos experimentadores entrenados que desconocían la identidad del grupo de la rata en el momento de la puntuación. La expresión y extinción de la memoria del miedo se presentan como un promedio del bloque 1 (tonos 1 y 2) durante las sesiones de prueba de cada día, ya que se puede observar la extinción dentro de la sesión.

Los objetos se construyeron a medida y se hicieron interactivos (escalables) para aumentar el tiempo de exploración y la adquisición de memoria, ya que el reconocimiento de objetos novedosos se utiliza normalmente para estudiar la memoria a corto plazo [31] (Figura complementaria S3). A las ratas se les permitió 10 minutos para familiarizarse con dos copias del objeto A o del objeto B. Al día siguiente, se les realizó una prueba de reconocimiento de objetos novedosos durante 5 minutos reemplazando uno de los objetos familiares por uno que era novedoso. Los datos se presentan como un índice de reconocimiento, definido como: tiempo dedicado a explorar un objeto novedoso/(tiempo dedicado a explorar un objeto novedoso + objeto familiar).

El comportamiento similar a la ansiedad basal se midió utilizando el paradigma del laberinto elevado en cruz (EPM) como se describió anteriormente [32, 33]. Los datos se representan como % de tiempo en el brazo abierto, es decir, tiempo en el brazo abierto/(tiempo en el brazo abierto + tiempo pasado en el brazo cerrado) *100.

La actividad locomotora se probó durante 30 minutos bajo niveles de luz ambiental (190–210 lux) en cámaras con aislamiento acústico (43 × 43 cm) equipadas con un sistema de detección de haz infrarrojo (Med Associates Inc.). Los datos se presentan como distancia acumulada recorrida en intervalos de 5 minutos.

Los umbrales de sensibilidad al impacto del pie se probaron en cajas de Med Associates. Las ratas fueron expuestas a descargas en las patas durante 0,5 s en incrementos de 0,1 mA, comenzando desde 0,1 mA, y un observador ciego calificó la retracción de 1, 2 y 4 patas.

Las ratas recibieron infusiones bilaterales en el dmPFC (0,25 µl/infusión; velocidad: 0,1 µl/min; anteroposterior: +3 mm, mediolateral: ±0,6 mm, dorsoventral: −3,5 mm [34] de un virus adenoasociado (AAV) que contiene un ARN de horquilla corta dirigido a Prdm2 (AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40; GGAGCCCAAGTCCTTGTAAAT; título: 5,6E13 GC/mL; UPenn Core Facility, Philadelphia, PA) o un control codificado (AAV9.HI.shR. luc.CMV.ZsGreen.SV40; título: 9,2E13 GC/mL; UPenn Core Facility, PA).

Las ratas recibieron infusiones bilaterales en el dmPFC (0,25 µl/inyección; velocidad: 0,1 µl/min; coordenadas: anteroposterior: +3 mm, mediolateral: ±0,6 mm, dorsoventral: −3,5 mm [34] de un AAV que contiene un Cre dependiente microARN dirigido a Prdm2 (AAV9.hSyn.DIO.-mcherry.miR.Prdm2.WPRE; GGAGCCCAAGTCCTTGTAAAT; título: 3,24E13 GC/ml; UPenn Core Facility, PA) o un control codificado (AAV9.HI.shR.luc.CMV. ZsGreen.SV40). Las ratas también recibieron infusiones bilaterales de un AAV transportado retrógradamente que codifica Cre (0,5 µl/infusión; velocidad: 0,1 µl/min; AAV-retro2-hSyn1-EGFP_iCre-WPRE-hGHp(A); título: 7,8 × 10E12 GC/mL; Addgene, Watertown, MA) en el BLA (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,4 mm [34]).

Las ratas recibieron infusiones bilaterales en el dmPFC de un vector AAV que contenía un shRNA dirigido a Prdm2 o un control codificado como se describió anteriormente. Las ratas también recibieron una infusión unilateral de un AAV que codifica GcaMP6s (0,5 µl/infusión; velocidad: 0,1 µl/min; AAV9.CaMKII.GcaMP6s.WPRE.SV40; título: 2,1E13 GC/mL; Addgene, Watertown, MA) en el BLA (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,4 mm). Después de las infusiones de vectores, se implantó una fibra óptica de borosilicato de 0,66 NA con núcleo de 400 µm unida a un receptáculo M3 de titanio (Doric Lenses, Ciudad de Quebec, Canadá) dorsal al BLA (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,5 milímetros). El receptáculo se fijó al cráneo con una combinación de tornillos para cráneo, superpegamento y acrílico dental negro Ortho-Jet (Riss-Dental, Hanau, Alemania).

Las ratas estaban acostumbradas a estar conectadas a un cable de conexión de fibra durante varios días antes de la sesión de acondicionamiento del miedo. La expresión de la memoria del miedo se evaluó nuevamente 24 h después del acondicionamiento, y la fluorescencia emitida por GCaMP6s como indicador de la actividad del calcio se midió durante toda la sesión utilizando métodos descritos previamente [35,36,37], con modificaciones menores. En resumen, los GCaMP6 se excitaron en dos longitudes de onda (465 nm, señal dependiente de calcio y control isosbéstico de 405 nm) mediante luz procedente de dos LED modulados sinusoidalmente (330 Hz y 210 Hz para 465 y 405 nm, respectivamente), reflejados en dicroicos. espejos (minicubo de fluorescencia de 4 puertos; lentes dóricas) y se acoplaron a un cable de conexión de fibra óptica de 0,57 NA de 400 μm que a su vez se conectó al implante de fibra. La intensidad de la luz para ambas longitudes de onda se ajustó a 10-15 µW en la punta del cable de conexión. Las señales emitidas por ambos canales luego regresaron a través de la misma fibra óptica y se adquirieron a 6,1 kHz utilizando un fotosensor integrado en el minicubo de fluorescencia, se demodularon (amplificación de bloqueo) y se digitalizaron a 1017,3 kHz, y se registraron mediante un procesador de señal en tiempo real ( RZ5D; Tucker Davis Technologies, Alachua, FL, EE. UU.). Las marcas de tiempo de comportamiento del inicio y compensación del tono (CS+) se digitalizaron mediante entrada TTL al procesador de señales en tiempo real desde las cámaras de comportamiento de Med-Associates.

Para análisis adicionales fuera de línea, solo se incluyeron ratas con una colocación correcta de las fibras y expresión de GcaMP directamente debajo de la punta de la fibra (inspección post mortem), así como actividad de calcio observable (inspección visual de los rastros de la sesión completa). Este análisis se realizó utilizando una interfaz gráfica de usuario (GUI) personalizada basada en scripts de Python. Las señales sin procesar de 465 nm y 405 nm se muestrearon primero (50 ×) y se suavizaron (filtro de promedio móvil de fase cero con tamaño de ventana de 10 muestras). A continuación, se crearon histogramas peri-evento prueba por prueba con una ventana de tiempo que abarca -30 sy 40 s alrededor del inicio del tono. Finalmente, se eliminaron las tendencias de los datos para eliminar los artefactos de movimiento, fotoblanqueo y flexión de fibras. Por prueba, las señales de ambos canales se ajustaron de forma independiente a una curva de tiempo mediante regresión polinómica lineal para generar una señal prevista para ambos canales. Restar la señal predicha de la señal bruta medida dio como resultado un ∆F para cada canal, que posteriormente se normalizó mediante la división por la señal predicha del canal, lo que resultó en ∆F/F. Luego, las señales sin tendencia de los canales de 465 nm y 405 nm se restaron entre sí para calcular una señal fluorescente de GCaMP dependiente de calcio normalizada (% ∆F/F).

Para identificar los mecanismos moleculares aguas abajo de Prdm2 KD, específicamente en las neuronas que se proyectan desde el dmPFC al BLA, utilizamos el método vTRAP de purificación ribosomal de traducción viral. En este método, una construcción que codifica una subunidad ribosómica marcada con proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) (L10a) se expresa selectivamente en poblaciones neuronales de interés, utilizando, por ejemplo, el sistema Cre/lox. Luego, la subunidad marcada con EGFP se incorpora a los ribosomas de las células transfectadas. Estos ribosomas etiquetados, junto con el ARN traductor unido a ellos, pueden aislarse mediante inmunoprecipitación y someterse a análisis de expresión génica utilizando RNAseq. La principal ventaja de utilizar TRAP es que el ARNm asociado a los ribosomas está en proceso de traducción. La traducción se produce después de que muchos de los eventos reguladores de la expresión génica ya han tenido lugar y, por lo tanto, la traducción del ARNm se correlacionará más estrechamente con los niveles de proteína [38].

Las ratas recibieron infusiones bilaterales en el dmPFC de un cóctel viral con 1:4 partes de un AAV9 que contenía un shRNA dirigido a Prdm2, o un control codificado, y 3:4 partes de un AAV5 que codifica una subunidad ribosómica etiquetada con EGFP dependiente de Cre ( EGFP-L10a; AAV5-FLEX-EGFPL10a; título: 7 × 10¹² vg/mL). Las ratas también recibieron infusiones bilaterales de Cre, que codifica AAV2-retro (0,5 µl/infusión; AAV-retro/2-hSyn1-mCherry_iCre-WPRE-hGHp(A); título: 5,0 × 10E12 vg/mL) en el BLA (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,4 mm) [34]. El aislamiento de las neuronas proyectantes dmPFC-BLA se realizó como se describió anteriormente [39]. En resumen, se diseccionó dmPFC y las muestras se homogeneizaron en tampón de lisis (HEPES-KOH 10 mM; pH 7,4, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, cicloheximida 100 mg/ml, RNasin; Promega y SUPERase-In™ , Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.; inhibidores de la RNasa e inhibidores de la proteasa sin EDTA completo, Roche, Basilea, Suiza). Las muestras se sometieron a tres pasos de centrifugación en los que se agregaron NP-40 al 10 % y DHPC 300 mM al sobrenadante después de la primera y segunda centrifugación, respectivamente. La inmunoprecipitación de polisomas se realizó utilizando anticuerpos monoclonales anti-EGFP (Memorial Sloan-Kettering Monoclonal Antibody Facility; nombres de clones: Htz-GFP-19F7 y Htz-GFP-19C8) unidos a estreptavidina recubierta con proteína L biotinilada (Pierce; Thermo Fisher Scientific). -perlas magnéticas conjugadas (Life Technologies). Luego se purificó el ARN utilizando el kit Absolutely RNA Nanoprep (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). La concentración y la integridad del ARN se midieron utilizando el ensayo bioanalizador RNA 6000 Pico (concentración de ARN: ~990 pg/μl, RIN 9,5–10) y se enviaron a la Infraestructura Nacional de Genómica (NGI, Suecia) para RNAseq.

Las muestras se secuenciaron en NovaSeq6000 (NovaSeq Control Software 1.7.0/RTA v3.4.4; Illumina, Inc., San Diego, CA, EE. UU.) con un 151nt(Read1)-10nt(Index1)-10nt(Index2)-151nt(Read2 ) configuración utilizando el flujo de trabajo 'NovaSeqXp' en la celda de flujo en modo “S4”. La conversión de Bcl a FastQ se realizó utilizando bcl2fastq_v2.20.0.422 del paquete de software CASAVA. La escala de calidad utilizada es Illumina 1.8.

La calidad de los datos de secuenciación se evaluó mediante FastQC y Preseq. ¡Se realizaron recortes de calidad y recortes para eliminar secuencias de adaptadores con TrimGalore! y Cutadapt en modo de recorte de extremos emparejados y con un límite de puntuación de Phred de calidad de 20. Se utilizó el software de alineación STAR para alinear las lecturas de secuenciación recortadas con el genoma de rata de referencia de Ensembl Rnor_6.0 con los datos de anotación asociados. La calidad de la alineación se evaluó utilizando Qualimap y el mapeo de lecturas alineadas con características genómicas se realizó con featureCounts. Los resultados se resumieron utilizando MultiQC.

Los análisis posteriores se realizaron con el lenguaje de programación R y Rstudio. La normalización de la varianza y el tamaño de la biblioteca de los datos de recuento se realizó aplicando una transformación estabilizadora de la varianza (VST) antes del análisis de componentes principales. El análisis de expresión génica diferencial se realizó con el paquete R DESeq2. Se utilizó un valor p ajustado de tasa de descubrimiento falso por debajo de 0,05 como punto de corte para la significación estadística.

Utilizamos el software Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Agilent Technologies) para identificar genes interconectados en una vía. La base de datos que respalda la IPA contiene más de 7 millones de hallazgos y se actualiza continuamente. El algoritmo utilizado por IPA nos permite identificar genes enriquecidos en una vía determinada. También proporciona predicciones de activación/inhibición de vías, lo que indica si los cambios en la expresión genética identificados pueden conducir a la activación o inhibición de una vía específica. Para explorar más a fondo los patrones subyacentes de nuestros datos de RNA-seq, realizamos un análisis de red de coexpresión de genes ponderados (WGCNA), utilizando el paquete WGCNA R con parámetros predeterminados. A través de este enfoque, se construyó una red de coexpresión de genes ponderada basada en datos de recuento de lecturas normalizados por VST. Se identificaron módulos de genes interconectados y altamente coexpresados utilizando un tamaño de módulo mínimo de 30 genes, y se fusionaron módulos con perfiles de expresión similares (correlación> 0,75). El análisis de expresión diferencial se realizó ajustando un modelo lineal a los datos utilizando el paquete limma en R, comparando los perfiles de expresión de cada módulo entre Prdm2 KD y muestras de control codificadas. Los genes del módulo se analizaron para determinar el enriquecimiento funcional basándose en datos de la base de conocimientos de Gene Ontology, utilizando el paquete R clusterProfiler.

Después de completar los experimentos 3 y 6, los cerebros se extrajeron y se congelaron instantáneamente. Se recogieron secciones de cerebro de 12 µm al nivel de dmPFC y se mantuvieron a -80 °C hasta su uso. La hibridación in situ se realizó siguiendo el manual del usuario del kit RNAscope Fluorescent Multiplex (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) y como se describió anteriormente [23]. La sonda Prdm2 (número de acceso NM_001077648.1) se adquirió de Advanced Cell Diagnostics (Newark, CA, EE. UU.). Brevemente, las secciones se incubaron a 40 °C con una serie de 4 sondas diseñadas para amplificar las transcripciones hasta un punto en el que puedan cuantificarse individualmente. Esto incluye la sonda objetivo Prdm2, una sonda preamplificadora, una sonda amplificadora y la sonda marcada fluorescentemente Atto 550 (roja) en el canal C1 para visualizar las transcripciones de Prdm2. Las microfotografías para la cuantificación se obtuvieron utilizando un microscopio confocal con un aumento de 20 × (Zeiss LSM 700; Carl Zeiss AG, Jena, Alemania). Los niveles de ARNm de Prdm2 se evaluaron como píxeles totales de la señal fluorescente. Supusimos que cada píxel representa una única molécula de ARNm. El total de píxeles positivos para Prdm2 se midió después de ajustar automáticamente el umbral utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.) [40].

Los cerebros se extrajeron rápidamente y se colocaron en una solución de corte a base de N-metil-D-glucamina (NMDG) helada que contenía (en mM): 92 NMDG, 20 HEPES, 25 glucosa, 30 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4, 2,5 KCl, 5 ascorbato de sodio, 3 piruvato de sodio, 2 tiourea, 10 MgSO4 y 0,5 CaCl2 (310 mOsm, pH 7,4). Se obtuvieron cortes cerebrales coronales agudos (250 μm de espesor) que contenían PFC o BLA utilizando un vibratomo (Leica VT1200 S, Leica Biosystems Inc., IL, EE. UU.). Después del corte, las rodajas se transfirieron a una cámara de retención llena con una solución de retención precalentada (aproximadamente 34 °C) que contenía (en mM): 92 NaCl, 20 HEPES, 25 glucosa, 30 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4, 2,5 KCl, 5 sodio. ascorbato, 3 piruvato de sodio, 2 tiourea, 1 MgSO4 y 2 CaCl2 (310 mOsm, pH 7,4). Posteriormente, la solución de retención se mantuvo a temperatura ambiente y después de >1 h de recuperación, se transfirió un único corte a la cámara de registro y se perfundió continuamente a un caudal de aproximadamente 2,0 ml/min con solución calentada (aproximadamente 30–32 °C). líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa, en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 11 glucosa, 26 NaHCO3, 2,4 CaCl2 (310 mOsm, pH 7,4). Todas las soluciones se saturaron con 95% de O2 y 5% de CO2. Las EPSC espontáneas (sEPSC) se registraron utilizando pipetas con parche de vidrio de borosilicato (2,5–3,0 MΩ; Harvard Apparatus, MA, EE. UU.) que contenían (en mM): 135 K-gluconato, 20 KCl, 10 HEPES, 0,1 EGTA, 2 MgCl2, 2 Mg. -ATP, 0,3 Na-GTP (290 mOsm, pH ajustado a 7,3 usando KOH). Las EPSC evocadas (eEPSC) se registraron utilizando una solución intracelular a base de Cs que contenía (en mM): 140 metanosulfonato de Cs, 5 NaCl, 1 MgCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 2 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, 5 QX- Cloruro 314 (290 mOsm, pH ajustado a 7,3 usando CsOH). La relación de pulsos emparejados se analizó como la relación entre eEPSC2 y eEPSC1 (0,05 Hz, intervalo entre pulsos de 50 ms, duración del estímulo de 50 μs). El cuadrado inverso del coeficiente de variación (1/CV2) se midió como la relación entre el cuadrado de la amplitud media y la varianza (μ2/σ2) de 20 eEPSC consecutivos (0,05 Hz). La relación varianza-media (VMR) se midió como la varianza dividida por la amplitud media (σ2/μ) de 20 eEPSC consecutivos (0,05 Hz). La relación AMPA/NMDA se midió dividiendo la amplitud máxima de la corriente mediada por AMPAR (medida a −70 mV) con el componente dependiente de NMDAR (medido a +40 mV, 50 ms después del inicio del eEPSC) en ausencia de Bloqueadores de los receptores glutamatérgicos. Todos los registros se llevaron a cabo en modo de fijación de voltaje con un potencial de retención de −70 mV y en presencia de los bloqueadores GABAR picrotoxina (100 μM) y CGP55845 (2 μM). El potencial de unión estimado fue de 11 mV para K-Gluc y de 8,5 mV para la solución intracelular a base de Cs y no se compensó durante los registros electrofisiológicos. Los resultados se analizaron mediante pruebas de Mann-Whitney y todos los reactivos y fármacos se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific.

Los datos de fotometría de fibra y de comportamiento se analizaron utilizando Statistica 13.0 (TIBCO Software, Palo Alto, CA, EE. UU.) y los gráficos producidos con Prism 9.1.2 (Graphpad Software LLC., San Diego, CA, EE. UU.). La normalidad se comprobó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Los datos de respuesta máxima de calcio tuvieron que transformarse logarítmicamente para ajustarse a la distribución normal antes del análisis. La homogeneidad de la varianza se evaluó mediante la prueba de Levene. Los datos no violaron el supuesto de homogeneidad y, por lo tanto, se analizaron mediante la prueba t de Student no pareada, ANOVA unidireccional o ANOVA de medidas repetidas bidireccionales, según corresponda. El nivel de significancia aceptado para todas las pruebas fue p < 0,05. Los datos se presentan como medias ± SEM, a menos que se indique lo contrario. El análisis de los datos de secuenciación de ARN y el registro electrofisiológico se describen anteriormente. El tamaño de la muestra para cada experimento se basó en la variación observada en experimentos y estudios piloto similares anteriores. Se eliminaron del estudio las ratas con inyección viral/fibra óptica que estaban fuera del área objetivo.

Para evaluar si Prdm2 KD afecta los procesos de memoria del miedo, las ratas recibieron microinfusiones bilaterales de un AAV que expresaba un shRNA dirigido a Prdm2 o un shRNA codificado en el dmPFC (Fig. 1A). Prdm2 KD resultó en una disminución de aproximadamente el 50% en la expresión de Prdm2 en el dmPFC (Fig. 1C, D; ANOVA unidireccional: F (1,17) <0,001, codificado: n = 9 y Prdm2 KD n = 10). Se realizaron pruebas en ratas para determinar la adquisición, expresión y extinción de la memoria del miedo 1 mes después de la infusión viral (Fig. 1E). Descubrimos que Prdm2 KD en el dmPFC no afectó la adquisición de la memoria del miedo (Fig. 1F), pero aumentó significativamente la expresión de la memoria del miedo 24 h después de la sesión de acondicionamiento, medida por una respuesta de congelación mejorada evocada por un tono (Fig. 2G). H; ANOVA unidireccional: F(1,35) = 11,55; p = 0,002; codificado: n = 17 y Prdm2 KD n = 20).

Un escaneo de mosaico representativo del sitio de inyección y propagación del virus. B, C Imágenes representativas utilizadas para la cuantificación de RNAscope. D KD de Prdm2 induce una regulación negativa significativa de Prdm2 en el dmPFC. E Cronograma experimental: el día 1, las ratas recibieron una infusión bilateral de un AAV9 que contenía un shRNA-Prdm2 o un control codificado. Luego se evaluó en ratas la adquisición del miedo (día 31), la expresión del miedo (día 32) y la extinción del miedo (día 33-34). F KD de Prdm2 no afectó la adquisición de la memoria del miedo (la adquisición de la memoria del miedo se presenta como un promedio de tonos 2 a 6 durante la sesión de acondicionamiento), pero G aumentó significativamente la expresión del miedo 24 h después del condicionamiento (indicado por el % de congelación ± SEM; N = 17–20/grupo). H Promedio de los 2 primeros tonos de la prueba de expresión de miedo. I Prdm2 KD no afectó la tasa de extinción, lo que indica que la interacción para el tiempo x grupo no fue significativa (es decir, pendientes similares). J En un lote separado (N = 12/grupo), se encontró que Prdm2 KD aumentaba la expresión de miedo también 1 semana después del acondicionamiento. K Cuando Prdm2 fue derribado 1 semana después de la adquisición del recuerdo del miedo (N = 18–20/grupo), no se observó ningún efecto en la expresión del miedo medida 1 mes después. *p < 0,05; **p < 0,01; p<0,001.

Prdm2 KD no afecta la sensibilidad al shock (A), la actividad locomotora (B), el reconocimiento de objetos novedosos (C) y la ansiedad basal (D).

A continuación, se evaluó la extinción de la memoria reexponiendo a los animales a la prueba de expresión, 48 h y 72 h después de la sesión de acondicionamiento. El ANOVA de medidas repetidas de dos vías mostró un efecto significativo del tiempo (F (2,70) = 64,2; P <0,001), lo que indica una extinción robusta, y un efecto significativo del grupo en la respuesta de congelación provocada por señales (Fig. 1I; F (1,70) = 9,64; p = 0,003). Sin embargo, las pendientes de las funciones de extinción fueron paralelas, lo que se refleja en una interacción de tiempo × grupo no significativa (F (2,70) = 1,58; p = 0,21). Por lo tanto, Prdm2 KD no cambió la tasa de extinción. Aunque la tasa de extinción no se vio afectada, también se observó una mayor expresión de miedo después de 3 días de sesiones de extinción de miedo en ratas con dmPFC Prdm2 KD en comparación con los controles codificados (F (1,35) = 4,10; P = 0,05). Esto sugiere un efecto persistente de Prdm2 KD sobre la expresión de la memoria del miedo. Luego probamos la expresión de la memoria del miedo en un momento posterior, 1 semana después de la adquisición, para evaluar el efecto a largo plazo de Prdm2 KD. Descubrimos que Prdm2 KD aumentó significativamente el porcentaje de tiempo dedicado a congelar también en este momento (Fig. 1J; ANOVA unidireccional: F (1,22) = 5,11; p <0,05; codificado: n = 12 y Prdm2 KD n = 12), lo que demuestra un efecto duradero de Prdm2 KD. En conjunto, estos datos establecen una regulación positiva de las respuestas de miedo condicionadas después de Prdm2 KD, con un curso temporal consistente con una reprogramación epigenética del transcriptoma.

Prdm2 KD aumentó específicamente la expresión del miedo sin influir en la adquisición del miedo (Fig. 1), lo que indica que PRDM2 no afecta los procesos de aprendizaje asociativo que vinculan el estímulo incondicionado (es decir, el choque del pie) con el estímulo condicionado (es decir, el tono). Prdm2 KD puede mejorar la expresión del miedo al modular los procesos involucrados en la consolidación de la memoria o la recuperación de la memoria. Para abordar esta pregunta, el AAV que contenía shRNA contra Prdm2 se infundió en el dmPFC una semana después del condicionamiento del miedo. Dado el tiempo necesario para que el shRNA reduzca de manera estable la expresión de Prdm2, la mayoría de los procesos de consolidación se habían formado en el dmPFC en ese momento [13, 41]. En estas condiciones, no observamos diferencias entre las ratas Prdm2 KD y los controles codificados (Fig. 1K; codificados: n = 20 y Prdm2 KD n = 18), lo que sugiere que Prdm2 KD en el dmPFC produce un aumento persistente en la expresión del miedo a través de efectos. en la consolidación de la memoria, en lugar del recuerdo de la misma.

No observamos efectos de Prdm2 KD sobre la sensibilidad al impacto del pie y la actividad locomotora, lo que sugiere un efecto específico de Prdm2 KD sobre la expresión del miedo (Fig. 2A, B; codificado: n = 20 y Prdm2 KD n = 20). También probamos si Prdm2 KD afecta otros tipos de memoria al realizar una nueva tarea de reconocimiento de objetos y no encontramos ningún efecto de Prdm2 KD en el índice de reconocimiento (Fig. 2C; codificado: n = 12 y Prdm2 KD n = 12). También se probó el efecto de Prdm2 KD sobre comportamientos similares a la ansiedad. Observamos una tendencia a una disminución del porcentaje de tiempo de brazo abierto en ratas Prdm2 KD. Sin embargo, esto no fue significativo, lo que sugiere que Prdm2 no afecta de manera significativa los comportamientos innatos similares a la ansiedad (Fig. 2D; codificados: n = 20 y Prdm2 KD n = 20).

Las proyecciones dmPFC -BLA participan en la mediación de la expresión del miedo [12, 13]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que Prdm2 KD puede aumentar la expresión del miedo al modular la actividad de las neuronas proyectantes dmPFC-BLA. Para abordar esta hipótesis, primero investigamos si una KD selectiva de Prdm2 en las neuronas proyectantes dmPFC-BLA era suficiente para aumentar la expresión del miedo. Utilizamos un enfoque de vector dual, en el que se inyectó un AAV transportado retrógradamente que codifica Cre en el BLA, y un microARN Prdm2 dependiente de Cre que codifica AAV se infundió en el dmPFC (Fig. 3A, B) [42]. De manera similar a lo que observamos con un Prdm2 KD en dmPFC que no era específico de la proyección, Prdm2 KD en neuronas proyectantes dmPFC-BLA no afectó la adquisición del miedo condicionado (Fig. 3C), pero aumentó significativamente la expresión de la memoria del miedo 24 h después. adquisición (Fig. 3D; ANOVA unidireccional: F (1,37) = 4,56; p <0,05; codificado: n = 20 y Prdm2 KD n = 19). No se observaron diferencias en la actividad locomotora o el comportamiento similar a la ansiedad en los grupos Prdm2 KD dmPFC-BLA en comparación con los controles codificados (Figura complementaria 4A. B, respectivamente). Se observó una tendencia a un porcentaje reducido de tiempo pasado en el brazo abierto en el grupo dmPFC-BLA Prdm2 KD, similar a la observada en el grupo dmPFC Prdm2 KD.

Un esquema que representa el enfoque viral dual. B Escaneos en mosaico que muestran la propagación viral en dmPFC y BLA e imágenes representativas que muestran neuronas dmPFC infectadas por AAV9-DIO-shRNA-PRDM2-ZS verde (verde), neuronas dmPFC infectadas por rAAV2 retro Cre-mCherry (rojo) y neuronas dmPFC que muestran Coinfección de AAV9-DIO-shRNA-PRDM2-ZS verde y rAAV2 retro Cre-mCherry (amarillo; barra de escala, 50 µm). C KD de Prdm2 en neuronas que se proyectan desde dmPFC a BLA no afectó la adquisición del miedo medida como% de congelación ± SEM. D Prdm2 KD en dmPFC-BLA fue suficiente para aumentar la expresión de miedo 24 h después del acondicionamiento (N = 19–20). *p < 0,05. BLA amígdala basolateral, corteza prefrontal dorsomedial dmPFC.

Para identificar los objetivos moleculares posteriores a través de los cuales Prdm2 KD regula la consolidación de la memoria de miedo aumentada por dmPFC-BLA, secuenciamos el translatomo de las neuronas dmPFC-BLA utilizando una estrategia vTRAP (Fig. 4A, B; codificados: n = 18 ratas; grupos de 3 dmPFC y Prdm2 KD n = 18 ratas; grupos de 3 dmPFC) [39].

Prdm2 KD en neuronas dmPFC-BLA regula genes implicados en la sinaptogénesis. Un esquema que representa el enfoque triple viral utilizado para el experimento vTRAP. Escaneos en mosaico B que muestran la propagación viral en dmPFC y BLA, así como neuronas dmPFC que presentan células infectadas por AAV5-FLEX-EGFPL10a (verde), células infectadas por rAAV2 retro Cre-mCherry (rojo) y células que muestran coinfección de AAV5. -FLEX-EGFPL10a y rAAV2 retro Cre-mCherry (amarillo). C Análisis de componentes principales que muestra la separación de muestras de Prdm2 KD y el control codificado en distintos grupos. D Gráfico del volcán que ilustra los genes alterados más significativamente después de Prdm2 KD. E Dendrograma de agrupamiento jerárquico que agrupa genes interconectados y altamente coexpresados. Los mapas de colores debajo del dendrograma corresponden a módulos de genes coexpresados. Mapa de colores superior: módulos identificados iniciales. Mapa de colores inferior: módulos después de fusionar módulos con perfiles de expresión similares. F Análisis de expresión diferencial para cada módulo de coexpresión, comparando Prdm2 KD con control codificado. La línea discontinua horizontal roja denota un nivel de significancia del valor p corregido por FDR de 0,05. G Diagrama de caja que compara el perfil de expresión génica del módulo "MEblue" entre condiciones. KD: Prdm2 KD, SCR: control de codificación. Prueba estadística: prueba t no pareada bilateral. H Enriquecimiento de ontología genética para genes en el módulo “MEblue”. I Análisis de redes genéticas realizado mediante IPA. Prdm2 KD aumenta la expresión de genes que codifican la familia de receptores de cadherina, neurexina/neuroligina y efrina/efrina, así como proteínas que pertenecen al complejo SNARE. J Expresión diferencial y nivel de significancia para genes seleccionados relacionados con la sinaptogénesis. La línea discontinua vertical en el gráfico de barras denota un nivel de significancia del valor p corregido por FDR de 0,05. BLA amígdala basolateral, corteza prefrontal dorsomedial dmPFC.

Descubrimos que Prdm2 KD fue suficiente para alterar el perfil traslacional de las neuronas dmPFC-BLA (Fig. 4C, D). Utilizando vTRAP-RNAseq, secuenciamos 22 091 genes y descubrimos que Prdm2 KD moduló la expresión de 3603 de ellos (Tabla complementaria 1: 1877 regulados al alza y 1726 regulados a la baja). Como se esperaba, Prdm2 KD disminuyó la expresión de Prdm2 (Tabla complementaria 1: adj p = 3.33E-23) en las neuronas dmPFC-BLA. El análisis WCNA identificó un total de 32 módulos de coexpresión de genes altamente correlacionados, que se fusionaron en 28 módulos distintos (Fig. 4E). Entre estos 28 módulos, el más grande llamado "MEblue" mostró una expresión diferencial significativa entre Prdm2 KD y el control codificado (Fig. 4F, G). Este módulo mostró un enriquecimiento de procesos biológicos como la organización de sinapsis y la regulación del potencial de membrana (Fig. 4H). También utilizamos IPA para agrupar genes según su función. Descubrimos que Prdm2 KD en las neuronas dmPFC-BLA modulaba la expresión de genes que se han asociado con el condicionamiento del miedo, la ansiedad, el comportamiento emocional y la memoria (Tabla complementaria 2). De acuerdo con el análisis de la WCNA, la red de genes más importante identificada por IPA incluyó cambios en la expresión génica asociados con la activación de la sinaptogénesis (Fig. 4I). Esta red constaba de genes que pertenecen a las familias de efrina, neuroligina y neurexina, así como genes asociados a SNARE (p. ej., sinaptotagminas, Fig. 4I, J). Se sabe que estas familias de genes contribuyen a la neurotransmisión y la formación de la memoria [43,44,45].

La reprogramación traslacional identificada por nuestro análisis de RNAseq señaló la posibilidad de que Prdm2 KD module la consolidación del miedo condicionado modificando la liberación sináptica de glutamato en los objetivos de proyección dmPFC -BLA. Para examinar esta posibilidad, llevamos a cabo experimentos de electrofisiología en cortes. Primero evaluamos los efectos de dmPFC Prdm2 KD en las propiedades sinápticas basales de BLA midiendo las sEPSC, registradas a partir de supuestas neuronas principales de BLA en controles codificados y ratas Prdm2 KD (Fig. 5A). Las ratas Prdm2 KD mostraron una mayor frecuencia de sEPSC en comparación con los controles revueltos (Fig. 5B, C; Revueltos: 3,74 ± 0,45 Hz, n = 14; Prmd2 KD: 5,63 ± 0,70 Hz, n = 15; t(27) = 2,24, p < 0,05, prueba t no apareada). Por el contrario, las ratas Prdm2 KD no mostraron diferencias significativas en la amplitud (Fig. 5D; Revuelto: 10,45 ± 0,41 pA, n = 14; Prmd2 KD: 10,71 ± 0,61 pA, n = 15; t(27) = 0,35, p = 0,73; prueba t no apareada) y cinética (Tiempo de subida: codificado: 2,16 ± 0,07 ms, n = 14; Prmd2 KD: 2,15 ± 0,06 ms, n = 15; t(27) = 0,08 p = 0,94, prueba t no apareada; Tiempo de caída: codificado: 10,93 ± 0,51 ms, n = 14; Prmd2 KD: 10,43 ± 0,31 ms, n = 15; t(27) = 0,85 p = 0,40, prueba t no apareada; datos no mostrados) de sEPSC. Estos datos sugieren que Prdm2 KD en dmPFC aumentó la liberación de glutamato en las neuronas principales de BLA.

Una imagen representativa que muestra la expresión viral (AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40) en terminales dmPFC dirigidas a BLA. B Trazas representativas de sEPSC registradas a partir de supuestas neuronas principales (PN) de BLA en ratas Scrambled o Prdm2 KD. Barras de escala: 50 pA × 500 ms. Distribuciones acumulativas y gráficos de barras que muestran la frecuencia (C) y la amplitud (D) de las sEPSC registradas a partir de supuestas PN BLA en ratas KD codificadas o Prdm2. E Representación esquemática de los sitios de electrodos de grabación y estimulación para grabaciones de (e)EPSC evocadas. F Rastros representativos de eEPSC evocados por estimulaciones eléctricas pareadas registradas a partir de supuestas BLA PN en ratas Scrambled o Prdm2 KD. Barras de escala: 50 pA × 25 ms. G Gráficos de barras que muestran los valores medios de PPR registrados a partir de supuestas PN BLA en ratas Scrambled o Prdm2 KD. Gráficos de barras que muestran los valores medios de 1/CV2 (H) y VMR (I) de eEPSC registrados en ratas KD Scrambled o Prdm2 (N = 5–6/grupo). *p < 0,05. J Esquema que representa el enfoque de fotometría de fibra (arriba) y una imagen representativa (abajo) que muestra la fibra óptica implantada dirigida al BLA y la expresión de dos virus, AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40 en terminales dmPFC dirigidos el BLA así como AAV9.CaMKII.GCaMP6s.WPRE.SV40 en neuronas glutamatérgicas BLA. K Trazas que muestran la señal fluorescente GCaMP dependiente de calcio normalizada (media ± SEM) en neuronas BLA de ratas KD Scrambled o Prdm2, promediadas sobre los primeros 2 tonos de la prueba de expresión de miedo. La duración del tono se indica mediante el cuadro gris sombreado. Gráficos de barras que muestran un pico más grande de señal de GCaMP normalizada en respuesta al inicio del tono (L) y un aumento del área bajo la curva (AUC) de la señal de GCaMP normalizada durante los 5 s que preceden al tono y los primeros 5 s de la presentación del tono (M) en Ratas Prdm2 KD en comparación con ratas de control revueltas. Amígdala basolateral BLA, amígdala central CeA, corteza prefrontal dorsomedial dmPFC, amígdala lateral LA, relación entre varianza y media de VMR, corrientes postsinápticas excitadoras espontáneas de sEPSC.

Para investigar si Prdm2 KD afecta la probabilidad de liberación, comparamos la relación de pulsos emparejados (PPR) de eEPSC eléctricamente registradas a partir de neuronas principales BLA putativas de controles codificados y ratas Prdm2 KD (Fig. 5E, F). De acuerdo con una mayor probabilidad de liberación de las entradas glutamatérgicas de BLA, observamos una PPR más baja en ratas Prdm2 KD en comparación con los controles revueltos (Fig. 5G; Revueltos: 1,39 ± 0,13, n = 19; Prdm2 KD: 1,02 ± 0,07, n = 16 ; p < 0,05, prueba de Mann Whitney). Además, para proporcionar una medida independiente de los cambios en la probabilidad de liberación, analizamos las alteraciones inducidas por Prdm2 KD en el cuadrado inverso del coeficiente de variación (1/CV2) y el VMR de los eEPSC [46]. Encontramos que las ratas Prdm2 KD exhiben un valor significativamente mayor de 1/CV2 (Fig. 5H; Revuelto: 18,14 ± 4,62, n = 19; Prmd2 KD: 36,46 ± 8,08, n = 16; p < 0,05, prueba de Mann Whitney). y un valor inferior casi significativo de VMR (Fig. 5I; Revuelto: 17,04 ± 3,90, n = 19; Prmd2 KD: 7,91 ± 1,69, n = 16; p = 0,08, prueba de Mann Whitney). Aunque no se pueden excluir cambios simultáneos en el número de sitios de liberación de vesículas funcionales, estos datos parecen consistentes con los resultados de PPR, lo que sugiere además una mayor probabilidad de liberación de las entradas glutamatérgicas al BLA después de dmPFC Prdm2 KD. Por último, medimos la relación AMPA/NMDA para determinar si Prdm2 KD también podría alterar la expresión funcional relativa de los receptores glutamatérgicos BLA AMPA y NMDA. Prdm2 KD no logró alterar la relación AMPA/NMDA (Figura complementaria 5; Revuelto: 2,97 ± 0,60, n = 12; Prmd2 KD: 2,76 ± 0,33, n = 12; p = 0,86, prueba de Mann Whitney), lo que indica la ausencia de Remodelación postsináptica en las sinapsis glutamatérgicas que convergen al BLA en respuesta a Prdm2 KD.

Nuestros datos de comportamiento y electrofisiología sugirieron que Prdm2 KD puede estar potenciando la expresión del miedo condicionado mediante señales al aumentar la reactividad de las neuronas piramidales BLA a las señales asociadas al miedo. Para probar esta hipótesis, utilizamos fotometría de fibra para medir la actividad neuronal BLA durante la expresión de la memoria de miedo (codificada: n = 9 y Prdm2 KD n = 13). Se inyectó unilateralmente un vector AAV que codifica el sensor de calcio fluorescente GCaMP6s bajo el control del promotor CaMKII en el BLA de ratas Prdm2 KD y controles codificados, seguido de la implantación de una fibra óptica (Fig. 5J). Las ratas se sometieron a una sesión de acondicionamiento del miedo y se evaluaron 24 h después para detectar la expresión de miedo condicionado inducida por señales, como antes, y se midió la actividad del calcio en el BLA durante la sesión de prueba. Confirmando nuestra hipótesis, se observaron cambios mayores en la fluorescencia de GCaMP durante las dos primeras presentaciones del tono asociado al miedo en ratas Prdm2 KD en comparación con los controles codificados (Fig. 5K). Este efecto se observó tanto al medir el pico de la señal de GCaMP normalizada en respuesta al inicio del tono (Fig. 5L; t(20) = 2,37, p = 0,03) como al calcular el área bajo la curva (AUC) de la señal de GCaMP normalizada. durante los 5 s que preceden al tono y los primeros 5 s de la presentación del tono (Fig. 5M; efecto del tratamiento: F(1,20) = 5,28; p = 0,03).

Informamos un papel mecanicista de la enzima epigenética PRDM2 en la modulación de la consolidación de la memoria del miedo a través de la regulación de la vía neuronal dmPFC-BLA. Mostramos que una mayor expresión de miedo después de Prdm2 KD puede resultar de una mayor expresión de genes implicados en la liberación de neurotransmisores, lo que lleva a una mayor actividad de las neuronas glutamatérgicas proyectantes dmPFC-BLA durante el recuerdo del miedo. En conjunto, nuestros hallazgos proporcionan un nuevo mecanismo molecular a través del cual la proyección dmPFC-BLA puede promover una respuesta de miedo excesiva y duradera.

Hay pruebas sustanciales que respaldan el papel de los circuitos de la corteza prefrontal y la amígdala en la regulación del miedo y la ansiedad [12,13,14]. Los estudios de imágenes funcionales en humanos muestran una mayor conectividad funcional entre la dmPFC/corteza cingulada anterior (ACC) y la amígdala durante el procesamiento de amenazas en individuos sanos [47]. En individuos con trastornos de ansiedad generalizada o social, los pacientes con los síntomas más graves también muestran la mayor conectividad dmPFC/ACC-amígdala, lo que sugiere que este circuito no sólo está involucrado en respuestas adaptativas sino también desadaptativas al estrés [48]. De acuerdo con el papel de la vía dmPFC/ACC-amígdala en las respuestas adaptativas al estrés, la investigación en animales muestra que la expresión del miedo depende fundamentalmente de la activación de la vía dmPFC-BLA [11]. El miedo condicionado con señales fortalece las sinapsis excitadoras de dmPFC en BLA [12], y el silenciamiento optogenético de las terminales dmPFC en BLA disminuye tanto la expresión del miedo como la evitación activa [13, 49].

Nuestros hallazgos son consistentes con estas observaciones y proporcionan un mecanismo molecular potencial sobre cómo pueden surgir respuestas de miedo desadaptativas. Mostramos que Prdm2 KD en la vía dmPFC-BLA es suficiente para potenciar la expresión del miedo condicionado. También encontramos que Prdm2 KD induce cambios profundos en el perfil traduccional de las neuronas dmPFC-BLA y promueve una mayor neurotransmisión glutamatérgica en BLA. Específicamente, Prdm2 KD modificó el perfil traduccional de 100 genes implicados en la sinaptogénesis, lo que sugiere que PRDM2 desempeña un papel importante en la regulación de las funciones sinápticas. Prdm2 KD aumentó la expresión de genes que codifican el complejo SNARE (sinaptotagminas y sintaxinas) y los canales de calcio tipo N. Además, Prdm2 KD aumentó la expresión de genes que pertenecen a familias de proteínas de adhesión celular (es decir, neurexinas; neuroliginas; efrinas) que se sabe que desempeñan un papel importante en la transmisión sináptica y la plasticidad sináptica [44, 45, 50]. Es importante señalar que en el enfoque vTRAP, sólo se secuencian los ARNm que están asociados con ribosomas (es decir, que están en proceso de traducción). Por lo tanto, la traducción de los ARNm está más estrechamente correlacionada con los niveles de proteína, lo que hace que los cambios en la traducción del ARNm después de Prdm2 KD tengan más probabilidades de afectar funcionalmente la actividad neuronal y, en consecuencia, temer los procesos de memoria. Nuestros hallazgos translatómicos indican fuertemente que Prdm2 KD facilita la liberación de neurotransmisores al aumentar la expresión de genes que controlan la fusión de vesículas sinápticas. Esta hipótesis está respaldada por nuestras grabaciones de parches que indican una mayor probabilidad de liberación de neurotransmisores en las entradas glutamatérgicas al BLA en ratas Prdm2 KD en comparación con los controles codificados. Además, las ratas Prdm2 KD mostraron una mayor actividad neuronal en BLA durante la expresión del miedo, lo que sugiere que Prdm2 KD puede mejorar la expresión del miedo a través de una mayor eficacia sináptica de las neuronas proyectantes dmPFC-BLA.

Nuestros datos también indican que Prdm2 KD potencia la expresión del miedo al aumentar la consolidación de la memoria del miedo, un proceso mediante el cual los recuerdos recién adquiridos se estabilizan para formar la memoria a largo plazo [51]. La fuerza de la consolidación de la memoria puede influir en la variación individual en las respuestas de miedo. Por ejemplo, la “sobreconsolidación” de un recuerdo asociado a un trauma puede inducir una respuesta más fuerte y hacer que un individuo sea más propenso a desarrollar ansiedad patológica relacionada con el trauma [52, 53]. De acuerdo con el papel de Prdm2 en la consolidación de la memoria del miedo, se descubrió que varios genes modulados por Prdm2 KD, incluido el factor neurotrófico derivado del cerebro y el gen de la proteína 1 de unión al elemento sensible al AMP cíclico, están asociados con la consolidación de la memoria del miedo [54 ,55,56,57]. Además, un estudio reciente de Chen et al. [58] demostraron que la consolidación de la memoria del miedo se asocia con una mayor expresión de genes que codifican proteínas del complejo SNARE y varias neuroliginas y neurexinas. En lo que podría compararse con un mecanismo de preparación, el aumento de la expresión de estos genes antes de la exposición al miedo puede contribuir a la posterior consolidación excesiva de los recuerdos del miedo. Debido a que la exposición prolongada del cerebro al alcohol regula negativamente la expresión de Prdm2 en el dmPFC [23], nuestros hallazgos también proporcionan un mecanismo candidato para una mayor vulnerabilidad a la sobreconsolidación patológica de los recuerdos de miedo en personas con trastornos por consumo de alcohol, en consonancia con la alta co -morbilidad por consumo excesivo de alcohol y trastorno de estrés postraumático [59].

En conclusión, proponemos un mecanismo novedoso para una mayor consolidación de la memoria del miedo, en el que la disminución de la expresión de Prdm2 en las neuronas proyectantes dmPFC-BLA da como resultado cambios translatómicos que promueven una mayor eficacia sináptica en BLA y un aumento de las respuestas neuronales dmPFC-BLA a señales asociadas al estrés. Este estudio también proporciona el primer conjunto de evidencia sobre el papel de PRDM2 en los trastornos relacionados con el estrés. Finalmente, dados nuestros hallazgos previos de que la dependencia del alcohol regula negativamente la expresión de dmPFC PRDM2 [23], proporcionamos un mecanismo candidato para la extensa comorbilidad del consumo de alcohol y los trastornos de ansiedad.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01827-w

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Agradecemos al Dr. K. Meletis por su ayuda con respecto al experimento vTRAP. Agradecemos al Dr. V. Loitto y al Centro Central: Unidad de Microscopía de la Facultad de Medicina de la Universidad de Linköping por su asistencia técnica. Agradecemos a las instalaciones centrales de NGI Stockholm - SciLifeLab por realizar la preparación de la biblioteca y la secuenciación del ARN. Este trabajo fue financiado por el Consejo Sueco de Investigación (Subvención No. 2013-07434), la Región Östergotland, Stiftelsen Psykiatriska Forskningsfonden, la Fundación Wallenberg y la Beca Knut och Alice Wallenberg Stiftelse. CC es becario de Medicina Molecular de Wallenberg y recibe un generoso apoyo financiero de la Fundación Knut y Alice Wallenberg. Los autores no informan sobre intereses financieros biomédicos ni posibles conflictos de intereses.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Linköping.

Estos autores contribuyeron igualmente: Riccardo Barchiesi, Kanat Chanthongdee.

Centro de Neurociencia Social y Afectiva, Departamento de Ciencias Biomédicas y Clínicas, Universidad de Linköping, S-581 85, Linköping, Suecia

Riccardo Barchiesi, Kanat Chanthongdee, Michele Petrella, Li Xu, Esi Domi, Gaelle Augier, Andrea Coppola, Joost Wiskerke, Ilona Szczot, Eric Augier, Markus Heilig y Estelle Barbier

Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina Hospital Siriraj, Universidad Mahidol, Bangkok, Tailandia

Kanat Chanthongdee

Centro Wallenberg de Medicina Molecular, Universidad de Linköping, Linköping, Suecia

Simon Söderholm y Claudio Cantù

Departamento de Ciencias Biomédicas y Clínicas, División de Medicina Molecular y Virología; Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Linköping, Linköping, Suecia

Simon Söderholm y Claudio Cantù

Unidad de Biología de las Adicciones, Departamento de Psiquiatría y Neuroquímica, Instituto de Neurociencia y Fisiología, Academia Sahlgrenska, Universidad de Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia

Ana Domi y Louise Adermark

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EB y MH conceptualizaron y diseñaron los estudios. EB diseñó y supervisó experimentos, analizó e interpretó los resultados. RB, KC, EB, EA y GA realizaron los experimentos de comportamiento. RB, KC, CA y EB realizaron el análisis molecular. EB, ED, RB, LX y MP realizaron cirugías. MP, AD, LA realizaron registros y análisis electrofisiológicos. SS y CC realizaron el análisis bioinformático de los datos de secuenciación de ARN. JW e IS analizaron los datos de fotometría de fibra. EB, RB y MH redactaron el manuscrito. Todos los autores han leido y aprobado el manuscrito.

Correspondencia a Estelle Barbier.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

La versión original en línea de este artículo fue revisada: En la versión original de este artículo, los nombres y apellidos de Riccardo Barchiesi, Kanat Chanthongdee, Michele Petrella, Li Xu, Simon Söderholm, Esi Domi, Gaelle Augier, Andrea Coppola, Joost Wiskerke , Ilona Szczot, Ana Domi, Louise Adermark, Eric Augier, Claudio Cantù, Markus Heilig y Estelle Barbier estaban estructurados incorrectamente. Los nombres se mostraban correctamente en todas las versiones en el momento de la publicación. El artículo original ha sido corregido.

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Reimpresiones y permisos

Barchiesi, R., Chanthongdee, K., Petrella, M. et al. Un mecanismo epigenético para la consolidación excesiva de recuerdos de miedo. Mol Psiquiatría 27, 4893–4904 (2022). https://doi.org/10.1038/s41380-022-01758-6

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Recibido: 17 de diciembre de 2021

Revisado: 09 de agosto de 2022

Aceptado: 18 de agosto de 2022

Publicado: 21 de septiembre de 2022

Fecha de emisión: diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01758-6

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