Estudios de viabilidad de endoscopia no lineal multimodal utilizando haces de fibras multinúcleo para escaneo remoto desde secciones de tejido hasta órganos en masa.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13779 (2023) Citar este artículo

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Aquí, informamos sobre el desarrollo y la aplicación de una sonda óptica de fibra óptica multinúcleo compacta para imágenes no lineales multimodales, que combina las modalidades sin etiquetas de dispersión Raman anti-Stokes coherente, segunda generación armónica y fluorescencia excitada por dos fotones. Las sondas de este diseño de fibra multinúcleo evitan piezas móviles y portadoras de voltaje en el extremo distal, lo que proporciona una compatibilidad mejorada prometedora con los requisitos clínicos en comparación con implementaciones de la competencia. Las características de rendimiento de la sonda se establecen mediante criosecciones delgadas y objetivos artificiales antes de evaluar la aplicabilidad a muestras clínicamente relevantes utilizando tejidos de intestino humano y porcino a granel ex vivo. Después de la reconstrucción de la imagen para contrarrestar la naturaleza inherentemente pixelada de los datos, las imágenes grabadas muestran una alta calidad de imagen y conformidad morfoquímica a nivel del tejido en comparación con las imágenes multimodales no lineales obtenidas con un microscopio de escaneo láser utilizando un objetivo de microscopio estándar. Además, se presenta un procedimiento de reconstrucción simple pero eficaz y se demuestra que produce resultados satisfactorios. Finalmente, se describe un camino claro para futuros desarrollos que faciliten la traducción de la sonda de fibra multimodal a la evaluación y aplicación clínica en el mundo real.

Las imágenes in vivo sin etiquetas de tejidos que proporcionan información morfológica y química son cruciales para muchas aplicaciones médicas previstas, en particular para un examen histopatológico no invasivo intraoperatorio de tejido. En los últimos años, se ha demostrado que combinar diferentes técnicas espectroscópicas en un enfoque de imágenes multimodal es beneficioso para cumplir con todos los requisitos de velocidad, profundidad de penetración y especificidad molecular1,2,3. Uno de esos enfoques es la microscopía Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS), que cogenera simultáneamente los otros dos efectos no lineales, fluorescencia excitada por dos fotones (TPEF) y segunda generación armónica (SHG), en un solo dispositivo de imágenes. CARS permite mapear una vibración molecular específica, siendo las elegidas con mayor frecuencia indicativas predominantemente de lípidos (p. ej., ~ 2855 cm-1, νs(CH2)) o proteínas (p. ej., ~ 2930, νs(CH3)), las cuales son abundantes en muestras biológicas. Por el contrario, TPEF se puede utilizar para abordar los autofluoróforos endógenos, sobre todo el NAD(P)H, que está omnipresente en los tejidos debido a su importancia para el metabolismo celular. Además, SHG es un proceso que sólo ocurre en materiales no centrosimétricos, lo que lo hace altamente específico para biomateriales cuasi cristalinos como fibras de colágeno o filamentos de miosina. Por lo tanto, la combinación de esas tres modalidades no lineales proporciona información valiosa sobre la morfoquímica de un tejido sin etiquetas.

En este contexto, hemos demostrado que la microscopía no lineal multimodal que combina CARS, SHG y TPEF permite la detección de estructuras características y los cambios moleculares que las acompañan de enfermedades generalizadas, en particular el cáncer4,5. Para facilitar la interpretación de los datos de imágenes CARS/SHG/TPEF, los algoritmos avanzados de procesamiento de imágenes pueden extraer automáticamente propiedades características6,7. Además, y junto con la evaluación automática, se podría demostrar que la información codificada en estas imágenes multimodales grabadas sin etiquetas también se puede traducir en imágenes computacionales de hematoxilina y eosina (H&E)8 mediante estadísticas multivariadas, que no solo aprovechan el cuerpo existente de conocimiento y formación de los profesionales médicos, pero también podría ayudar a la aceptación transitoria. Para generar dichas imágenes H&E computacionales y/o proporcionar una evaluación automatizada de datos de imágenes no lineales multimodales, incluida la clasificación de la enfermedad o la segmentación visual como base para una mayor toma de decisiones clínicas, en el sitio y directamente durante la cirugía, se pueden usar dispositivos endoscópicos portátiles compactos. son requeridos. Con escenarios de aplicación que van desde la detección de márgenes tumorales en heridas quirúrgicas hasta la investigación de síntomas y la detección, clasificación y monitorización de enfermedades en órganos huecos (por ejemplo, enfermedad inflamatoria del cuenco9), el desarrollo de dispositivos endoscópicos para imágenes espectroscópicas no lineales ha sido un tema de gran interés. durante muchos años. Se han presentado diferentes enfoques: además de las sondas de escaneo puntuales10, los más comunes son los endoscopios de fibra de escaneo11,12,13,14,15,16,17,18 y el uso de espejos de escaneo galvo o escáneres de sistemas microelectromecánicos (MEMS)19,20,21. 22,23,24.

Si bien las sondas de escaneo puntual no proporcionan información espacial, los otros tipos de dispositivos contienen piezas optomecánicas móviles delicadas que los hacen susceptibles a desalineaciones y fallas operativas a largo plazo, lo que afecta negativamente su confiabilidad y hace necesario un mantenimiento regular por parte de personal calificado. Las condiciones adversas de los procedimientos de esterilización típicos, como el autoclave, son de particular preocupación a este respecto, al igual que las fuerzas mecánicas que probablemente surjan durante la manipulación general. El uso de dispositivos de escaneo en el cabezal de la sonda se puede evitar utilizando fibras de imágenes de núcleos múltiples para administrar los pulsos del láser de excitación. Estas fibras de imágenes, como la FIGH-10-500N de Fujikura Ltd. Japón, constan de varios miles de elementos conductores de luz coherentes, que preservan la relación espacial entre los dos extremos de la fibra. Se demostró que estos haces de fibras se pueden utilizar con fines de obtención de imágenes cambiando el procedimiento de escaneo láser del extremo distal al proximal de la fibra25,26,27,28,29,30. Trabajos anteriores han demostrado que también es posible obtener imágenes CARS utilizando dichos haces de fibras31 y que la integración en una sonda de fibra compacta es posible utilizando ópticas de índice de gradiente (GRIN)32. Sin embargo, para mitigar el ensanchamiento temporal y espectral, se recomienda emplear láseres de picosegundos como fuente de excitación. Las características de dispersión asociadas con la óptica de índice de gradiente (GRIN) y las fibras ópticas, particularmente cuando se utilizan con un láser de femtosegundo, se han examinado minuciosamente y se pueden encontrar en la literatura citada en33. Además de los beneficios previstos con respecto a la estabilidad a largo plazo de dicha sonda, el diseño totalmente óptico evita piezas portadoras de corriente en el cabezal de la sonda, mientras que los enfoques de escaneo mencionados anteriormente requieren altos voltajes, lo que exige la evaluación de riesgos potenciales. para el paciente y probablemente complicando la aprobación de la tecnología.

A pesar del atractivo obvio de este enfoque, hasta donde sabemos, el trabajo previo32 de nuestro grupo todavía representa el único ejemplo publicado de un endoscopio coherente basado en haces de fibras que demostró el registro simultáneo de CARS, TPEF y SHG. Si bien TPEF y SHG son notablemente más fáciles de implementar, CARS, a pesar de ser una modalidad particularmente deseable para el análisis de muestras biológicas, sigue siendo un desafío. Sin embargo, dado que estos estudios previos31,32 se centran principalmente en la realización técnica, los aspectos de caracterización y algunas imágenes de prueba de concepto de baja fidelidad de secciones delgadas de tejido, surgen dudas sobre la aplicabilidad general a muestras del mundo real en aspectos prácticos. , la calidad de imagen que se puede lograr y las rutinas de procesamiento de datos adecuadas siguen sin abordarse lo suficiente. En esta contribución, se presenta un diseño de sonda mejorado y una estrategia de análisis de datos, lo que permite la aplicación a muestras y escenarios médicamente más relevantes.

Después de una breve revisión del diseño de la sonda, incluidas sus mejoras técnicas, en primer lugar se establecen las características generales de rendimiento, particularmente en lo que respecta a la resolución óptica. Utilizando una sección delgada seca de tejido canceroso de cabeza y cuello humano como una muestra biológica plana y bien definida que proporciona contraste en los tres canales, se analiza la conformidad con las mediciones basadas en LSM (microscopio de barrido láser). Luego, se presenta una serie de mediciones de perlas de polímero de diferentes tamaños para evaluar la resolución óptica y sus limitaciones debido al escaso muestreo. Se analizan los límites de resolución si el muestreo escaso de núcleos de fibras individuales se contrarresta tomando múltiples mediciones desplazadas espacialmente. Estos hallazgos se prueban en una sección delgada de tejido hepático murino. Una vez establecidas las características de rendimiento, la parte central del estudio presentado se concentra en dos aspectos: la reconstrucción de imágenes para proporcionar imágenes fácilmente legibles por humanos y la aplicabilidad de la sonda a muestras voluminosas más representativas del escenario de aplicación previsto de mediciones in vivo para mediciones espectrales in situ. histopatología. Para ello, se investigan ex vivo segmentos de la pared intestinal porcina y humana como muestras realistas y médicamente relevantes.

La sonda de fibra y la configuración experimental general, incluidas las fuentes de luz, el LSM y la configuración de detección de tres canales, se han descrito con gran detalle en otro lugar32. El elemento clave de la sonda de fibra es la fibra de imagen coherente que consta de ~ 10 000 núcleos individuales (FIGH-10-500N, Fujikura Ltd. Japón) para emitir los rayos láser de excitación, junto con un sistema óptico de corrección de color y campo de imagen. Aquí, aplicamos un diseño de sonda refinado con mejoras técnicas en términos de iluminación láser y eficiencia de recolección de señales. Si bien los estudios anteriores se centraron en CARS, para garantizar un rendimiento óptimo también en el canal TPEF y SHG para los fines de este trabajo, el filtro de paso largo empleado anteriormente (LP02-830RE, Semrock, EE. UU.) se cambió por un divisor de haz dicroico (Di02-R785 ) que proporciona una mayor transmisión (> 90%) en el rango de longitud de onda de 400 a 780 nm. La lente GRIN y el conjunto DOE se fabricaron con tolerancias más estrictas, minimizando el viñeteado y los errores cromáticos de la bomba y los haces de Stokes. Además, el cabezal de la sonda se refinó con una nueva carcasa metálica para proteger y reforzar la conexión de fibra que de otro modo sería frágil. Por la misma razón, se aplicaron a las fibras tubos de endoscopio y conectores SMA aprobados por el Reglamento de dispositivos médicos (MDR). Se ha utilizado un LSM casero para acoplar los pulsos de láser de excitación generados por un láser Nd:VAN de modo bloqueado de 80 MHz (picoTRAIN, High Q Laser, Austria) en combinación con un oscilador óptico paramétrico (Levante Emerald, APE, Alemania). a 816 nm (bomba) y 1064 nm (Stokes) en la fibra de imágenes34. Este par de longitudes de onda corresponde a una resonancia Raman de 2850 cm-1, que coincide con la vibración de estiramiento simétrica de los grupos CH2 particularmente abundantes en los lípidos, lo que da como resultado una señal CARS a 661,8 nm. Como longitud de onda de excitación para la modalidad SHG, utilizamos el haz de 1064 nm, mientras que ambos haces sirvieron como fuente de excitación para la modalidad TPEF. El extremo proximal de la fibra de imágenes se coloca en el plano focal del LSM, donde se escanea mediante dos espejos galvo en un patrón de trama densa, mientras que el extremo distal de la sonda se coloca en la muestra de tejido. El diámetro completo del círculo de la imagen mide ~ 460 µm; sin embargo, se utiliza un campo de escaneo reducido (~ 260 µm) en la región central de la fibra de imagen para evitar daños en los núcleos de la fibra, que podrían haber sido causados durante el proceso de fabricación de la fibra. cabeza de sonda. La potencia de los rayos láser en el sitio de la muestra fue de aproximadamente 50 mW para la bomba y 25 mW para Stokes en la medición de la sonda y 70 mW para la bomba y 40 mW para Stokes en las grabaciones LSM. La potencia promedio del láser utilizada para las imágenes endoscópicas no lineales proporcionó suficiente generación de señal a partir de las muestras presentadas sin causar daños visibles a ninguna de ellas y se alinea con las escalas de potencia utilizadas en aplicaciones de imágenes endoscópicas no lineales comparables18,35 con el uso de pulsos de láser de picosegundos. Un punto de referencia útil en este contexto lo proporcionan Galli et al.36, quienes investigaron el fotodaño en condiciones de excitación similares en función de las repeticiones de fotogramas registradas. En la Fig. 1a se muestra una configuración esquemática del LSM acoplado a la sonda. La Figura 1b muestra el diseño óptico interno del cabezal de la sonda. Dos divisores de haz dicroicos de muesca (NFD01-532 (Semrock, EE. UU.) y F73-067 (Chroma, EE. UU.)) y tres filtros de paso de banda (FF01-661/20 (Semrock, EE. UU.), FL532-10 (Thorlabs, EE. UU.) y FF01 -550/88 (Semrock, EE. UU.)) además de un filtro de paso corto (FESH0700, Thorlabs, EE. UU.) para separar las señales de muestra. En la versión de diseño actual, todas las ópticas están diseñadas para medir a través de 170 µm de vidrio. Para una creación de prototipos más sencilla y una mayor versatilidad en la fase de prueba, el diseño actual no incluye una ventana de vidrio fija y, en cambio, se basa en un cubreobjetos que se coloca sobre la muestra. El diseño de la sonda es en gran medida independiente del LSM específico utilizado y podría, por ejemplo, combinarse con un sistema láser compacto basado en fibra y un cabezal de escaneo para incorporarse a una estación móvil, como se demostró recientemente para un endoscopio no lineal de cuerpo rígido35. En la Tabla 1 se ofrece una descripción general de las características estructurales y de rendimiento clave de la sonda.

(a) Configuración experimental con un microscopio de barrido láser acoplado a la sonda. Los láseres de excitación se acoplan a la fibra de imágenes mediante un microscopio de barrido láser. La luz es transferida por la fibra de imágenes y enfocada frente al cabezal de la sonda, donde se genera la señal no lineal dentro de la muestra de tejido. La señal es recogida por una fibra multimodo y guiada a una configuración de detección con tres canales de detección simultáneos. (b) Diseño de sonda de fibra interna. (c) Imagen teñida con H&E de un tejido canceroso de cabeza y cuello. Asignación: epitelio escamoso (SE), tejido conectivo (C) y región de células tumorales (TC). (d) Vista ampliada y detallada del área marcada en (c). (e) Imagen multimodal de la misma región registrada con un microscopio de barrido láser convencional. (f) Serie fusionada de imágenes de sondas de fibra sin procesar de la misma región. (g) La misma imagen que se muestra en (f) después de aplicar un algoritmo de procesamiento de imágenes presentado en la sección de procesamiento de imágenes. (h – j) Vista ampliada y detallada de las áreas marcadas en (e), (f) y (g), respectivamente. Codificación de colores: rojo—CARS, azul—SHG, verde—TPEF. Tamaño de mosaico en imágenes de sonda de fibra: 207 × 207 µm2.

Para demostrar el rendimiento de la sonda refinada como dispositivo de imágenes endoscópicas, se tomaron imágenes de una sección de tejido canceroso de cabeza y cuello humanos (20 µm, criosección nativa secada al aire). La sonda se colocó directamente encima de la sección delgada de tejido mientras una platina motorizada la movía. La Figura 1f muestra una serie de imágenes multimodales fusionadas (mosaicos de 12 por 12, desplazamiento lateral de 190 µm) sin ningún posprocesamiento aplicado, excepto ligeros ajustes de brillo para una visualización adecuada. Las imágenes se sobremuestrearon significativamente para proporcionar la máxima flexibilidad en el procesamiento de datos y una base de calidad de imagen alcanzable. El tiempo de adquisición para un solo mosaico fue de 32 segundos con una resolución digital de 2048 por 2048 píxeles con un tiempo de permanencia de píxeles de 2 µs y un promedio de cuadros de cuatro veces. Bajo algunas suposiciones y aproximaciones, la relación señal-ruido máxima para un solo cuadro se puede estimar en 52 para CARS y 11 para TPEF/SHG (ver SI para más detalles). En comparación con los resultados anteriores32, el diseño refinado de la sonda muestra una eficiencia de recolección de señales significativamente mayor para las tres modalidades no lineales. La imagen multimodal que se muestra en la Fig. 1f refleja la estructura morfoquímica del tejido canceroso de cabeza y cuello humano compuesta de CARS pronunciados de estructuras ricas en lípidos, TPEF de autofluoróforos endógenos (elastina, NADH, FAD) y SHG de fibras de colágeno. La morfología del tejido se correlaciona bien con una imagen teñida con H&E de la misma sección de tejido, incluido el epitelio escamoso (SE), el tejido conectivo o estroma (C) y las regiones con células tumorales (TC) en las figuras 1c, d. Pudimos adquirir señales CARS y TPEF en la zona del epitelio correspondiente a lípidos y elastina, que también se pueden observar en el resto del tejido. Además, las fibras de colágeno y elastina, como una combinación de señales SHG y TPEF (vistas en color azul claro), se pueden visualizar muy bien dentro del área de tejido conectivo confirmado mediante tinción H&E. La misma región investigada por la sonda fue registrada por un LSM convencional (Fig. 1e) con los mismos parámetros de escaneo descritos anteriormente para comparación directa, con la única diferencia de un desplazamiento lateral de 550 µm para tener en cuenta un campo de visión más grande. Se puede ver que la morfoquímica observada dentro de la imagen LSM (Fig. 1e) se corresponde bien con la registrada con la sonda de fibra (Fig. 1f). Sin embargo, la imagen grabada con la sonda, en comparación con la imagen LSM, muestra una estructura bastante pixelizada con una resolución espacial más baja debido a la composición de múltiples núcleos de la fibra de imagen (ver Fig. 1e, f). Se desarrolló y aplicó un algoritmo de procesamiento de imágenes que contrarresta la pixelización (que se describirá más adelante con gran detalle) para corregir la estructura pixelada. El resultado se muestra en la Fig. 1g. Se puede ver que el diseño de la sonda de fibra combinado con algoritmos de procesamiento de imágenes apropiados produce una imagen no lineal multimodal de la sección delgada de tejido con una calidad de imagen comparable a la obtenida con el LSM convencional. Cabe destacar que las regiones tumorales aparecen notablemente más brillantes en el canal TPEF que las regiones sanas circundantes debido al aumento de la autofluorescencia, lo que concuerda con informes anteriores para muestras de cáncer de cabeza y cuello, lo que subraya la conformidad morfoquímica6,37. La siguiente sección evaluará la influencia de este efecto de pixelización en la resolución óptica del cabezal de la sonda.

La comparación entre las imágenes grabadas con el LSM y la sonda de fibra analizadas en la sección anterior (ver Fig. 1e vs. f) muestra una limitación de la sonda de fibra, que es la estructura de la imagen pixelada. A continuación, nuestro objetivo es evaluar el rendimiento óptico del cabezal de la sonda con respecto a la influencia de esta pixelización en la resolución espacial dentro del plano focal. Para ello, se simuló una función de dispersión de puntos (PSF) policromática con respecto a todas las ópticas incorporadas dentro del cabezal de la sonda, excluyendo la fibra de imagen. Según la simulación, una fuente puntual idealizada en el plano del objeto conduce a un diámetro de punto FWHM de 1,6 µm en el plano de imagen de la sonda. Para estimar el tamaño real del foco, se debe considerar la fibra de imagen con sus diámetros de núcleo individuales que oscilan entre 2,2 y 3,7 µm. Al convolucionar el PSF simulado con un diámetro medio del núcleo de 2,9 µm38, se puede calcular un tamaño de punto focal real de 3,3 µm. Sin embargo, sólo se puede lograr una resolución adecuada tomando varias imágenes de la misma muestra con posiciones de sonda ligeramente desplazadas, es decir, menos que el diámetro central promedio entre cada imagen. Para demostrar el límite de resolución puramente óptica de la sonda de fibra, se tomaron imágenes CARS (2850 cm-1) de grupos de perlas de poliestireno (PS) y polimetacrilato de metilo (PMMA) con diferentes diámetros (3 µm, 6 µm y 8 µm) y un La criosección de tejido hepático (20 µm, ratón) se midió con un cambio posicional de 1 µm para 100 imágenes (10 por 10 mosaicos). El tiempo de adquisición de una sola imagen fue de 8 s con una resolución digital de 1024 por 1024 píxeles, un tiempo de permanencia de píxeles de 2 µs y un promedio de cuadros cuatro veces mayor. En la Fig. 2, las imágenes de CARS superpuestas de patrones de 10 por 10 de cada muestra muestran una mejora espectacular al reconstruir el espacio entre los núcleos. Se puede ver que las perlas de 3 µm (Fig. 2a, b) no se resuelven bien con patrones ondulados entre objetos vecinos en áreas donde están densamente empaquetados, mientras que las perlas de 8 µm (Fig. 2c) se resuelven fácilmente, como se esperaba de la imagen anterior. predicciones teóricas. Esto se vuelve aún más evidente al observar los perfiles de intensidad (Fig. 2e) seleccionados de las áreas marcadas en las Fig. 2a-c. Teniendo en cuenta la estructura no homogénea de la imagen debido a los diferentes tamaños y espaciado de los núcleos, las perlas densamente empaquetadas y el fondo CARS no resonante, es un desafío dar un valor específico para la resolución espacial. Sin embargo, la Fig. 2e muestra que la separación de dos máximos mejora notablemente de perlas de 3 a 8 µm. La Figura 2d demuestra este enfoque para una muestra histológica, visualizando la microarquitectura esponjosa única del hígado de sinusoides alternos (sin contraste/bajo contraste) y hepatocitos (alto contraste). En este caso, el muestreo denso del plano mediante la grabación repetitiva de imágenes desplazadas espacialmente lleva la resolución a niveles ligeramente subcelulares. Como resultado, algunos núcleos se vuelven visibles como discos redondos oscuros (flechas blancas, véase por ejemplo39, p. 232).

Imágenes CARS de (a) perlas de PS con un diámetro de 3 µm, (b) perlas mixtas de PMMA y PS con diámetros de 3 µm y 6 µm, respectivamente, (c) perlas de PS con un diámetro de 8 µm. (c) -1 imagen superpuesta, (c) -2 un solo disparo con normalización, (c) -3 un solo disparo con normalización y un filtro de paso de banda FFT. (c)-1 a (c)-3 son secciones del mismo campo de visión. (d) Criosección de tejido hepático de ratón con un espesor de 20 µm (rojo: CARS, verde: TPEF). (e) Perfil de intensidad normalizado de las áreas indicadas en (a – c) con un promedio en la dirección perpendicular a los ejes largos del rectángulo. Se recortaron las áreas que no estaban cubiertas por los 100 mosaicos en (a – d). Tamaño final pieza: 210×210 µm2.

Sin embargo, la aplicación de un procedimiento de registro de este tipo conduciría a un aumento significativo en el tiempo total de adquisición, que no es tolerable para mediciones in vivo y, en la etapa actual, es, por lo tanto, de interés principalmente teórico. En el caso de imágenes individuales, la estructura de la fibra y la distancia entre los núcleos individuales determinan en gran medida la resolución real de la sonda de fibra. Con una distancia media entre centros de núcleo a núcleo de 4,6 µm y de acuerdo con el teorema de muestreo de Nyquist y Shannon, la estructura periódica más pequeña que la sonda puede resolver con un solo disparo tiene una longitud de paso de 2,3 * 4,6 ≈ 10,6 µm (ignorando el tamaño del punto focal). Sin embargo, una ligera variación en los tamaños, formas y distancias de los núcleos (ver también la Fig. S2) cambiaría ligeramente ese número, localmente. Aunque esta resolución puede parecer menos competitiva en comparación con las resoluciones micrométricas y submicrónicas informadas en otros estudios18,35,40,41, es esencial señalar que este endoscopio multinúcleo basado en fibras se conceptualizó de manera diferente. Su objetivo principal es facilitar la obtención de imágenes no lineales a nivel de tejido sin la necesidad de piezas electrónicas y móviles en el endoscopio. La resolución estimada de 10,6 µm es consistente con los resultados experimentales, como se puede ver al comparar una imagen superpuesta (Fig. 2c-1) y una sola imagen (Fig. 2c-2, c-3). Cabe mencionar que probablemente sea cercano al óptimo para las longitudes de onda empleadas, ya que densidades de núcleo más altas conducen a un mayor acoplamiento entre núcleos. La fibra FIGH-10-500N utilizada en este estudio logra un equilibrio entre una densidad de núcleo relativamente alta (y por lo tanto de píxeles) y mantener el acoplamiento entre núcleos al mínimo. En combinación con un grado deseable de falta de uniformidad en la estructura central, que minimiza aún más el grado de acoplamiento entre núcleos, es particularmente adecuado para nuestra aplicación26,38 y además ayuda por el hecho de que las modalidades no lineales generalmente se ven menos afectadas por la debilidad entre núcleos. acoplamiento que los lineales. En la sección S8 del SI se ofrece una discusión detallada. Dado que el diseño de sonda presentado no tiene como objetivo realizar exámenes a nivel subcelular sino más bien distinguir entre diferentes estructuras morfoquímicas a nivel de tejido, la resolución proporcionada por la sonda es suficiente para su propósito, como se mostrará en las siguientes secciones. Sin embargo, debe mencionarse que, en un modo de operación portátil prospectivo y en combinación con un seguimiento posicional preciso o una unión digital en tiempo real, las condiciones que conducen a las mejoras de resolución descritas anteriormente pueden surgir de manera bastante natural durante el proceso (semi)continuo. movimientos de escaneo.

Como se mencionó anteriormente, la composición de múltiples núcleos de la fibra de imágenes conduce a una estructura de imagen pixelada (ver Fig. 1d), que tiene dos efectos adversos: (1) la morfoquímica del tejido no está bien representada, lo que dificulta el juicio cualitativo; (2) las características de textura utilizadas para los enfoques de análisis de imágenes6,7,8 están fuertemente influenciadas por la estructura pixelada, lo que hace que el análisis cuantitativo sea un desafío. Por lo tanto, se requieren pasos de posprocesamiento para eliminar la estructura central de las imágenes y reconstruir los datos. Idealmente, este posprocesamiento debería permitir una corrección de la transmisión de núcleos de fibra individuales, asegurando la comparabilidad de diferentes áreas en una imagen, así como la comparabilidad entre sondas, y no debería ser demasiado exigente desde el punto de vista de los cálculos para, en perspectiva, permitir el procesamiento en línea. . Hay tres categorías básicas de estrategias establecidas para resolver el problema de pixelación que surge de la obtención de imágenes utilizando haces de fibras coherentes42: filtros de promedio espacial, filtrado espectral y métodos de interpolación. Descubrimos que estos métodos establecidos arrojaban resultados insatisfactorios y desarrollamos una metodología personalizada que se describe a continuación. En el SI se proporciona una comparación cualitativa detallada de los métodos basados en el trabajo de Shinde y Matham42.

La reconstrucción se logra mediante el flujo de trabajo de corrección de imágenes que se muestra en la Fig. 3. Como ejemplo, se muestran mosaicos de 3 por 3 de la esquina superior derecha del tejido de la cabeza y el cuello humanos que se muestran en la Fig. 1. En un primer paso, la pila original de imágenes que tiene un desplazamiento de aproximadamente una distancia entre centros de núcleo a núcleo en 100 mosaicos debido a las diferentes condiciones de acoplamiento del láser se somete a un procedimiento de alineación de la pila para garantizar posiciones consistentes del núcleo de fibra en cada imagen de la pila. (Figura 3a). Después de la alineación, la pila se reduce para reducir el tiempo de procesamiento en cálculos adicionales, preservando 2 * 2,3 píxeles por distancia entre centros de núcleo a núcleo (Fig. 3b). En una estructura estrictamente periódica (ortogonal), 2,3 píxeles serían suficientes para muestrear la matriz del núcleo de la fibra según el criterio de Nyquist. El factor de 2 explica las variaciones en los diámetros del núcleo y el empaquetamiento imperfecto del núcleo. A continuación, se calcula una proyección mediana (Fig. 3c) de la pila reducida para estimar la eficiencia local de cada núcleo de fibra. Luego, cada valor de píxel en cada imagen de la pila reducida se divide por el valor de píxel correspondiente de la proyección mediana para normalizar los cambios locales en la eficiencia (Fig. 3d). Este procedimiento tiene en cuenta las transmitancias de los núcleos individuales sin necesidad de una medición de referencia externa. Si bien este procedimiento exacto requiere que estén presentes datos sin procesar en forma de múltiples imágenes, debe tenerse en cuenta que la proyección mediana utilizada para la normalización no necesariamente tiene que provenir de la misma medición, es decir, las mediciones de imágenes individuales son, por supuesto, posible si se dispone de un mapa de proyección mediana antiguo. Para aplicaciones prácticas, sería beneficioso mantener una mediana de los últimos 100 fotogramas, ya que esto llevaría a la calibración automática en caso de que las condiciones de desacoplamiento cambien ligeramente a lo largo de la vida útil del cabezal de la sonda.

Flujo de trabajo de corrección de imágenes. Como ejemplo se utiliza un área del tejido de la cabeza y el cuello humanos en la Fig. 1. (a) Imágenes alineadas con posiciones centrales corregidas en toda la pila. (b) Las imágenes se reducen a una escala de píxeles adecuada para ahorrar tiempo de cálculo. (c) Proyección mediana de la pila reducida. (d) Pila dividida por la proyección mediana para la normalización. (e) Imagen de mosaico cosida mediante fusión lineal en áreas superpuestas. (f) Imagen procesada después de aplicar un filtro de paso de banda FFT.

Las imágenes resultantes de la pila normalizada luego se unen en una imagen de mosaico utilizando una combinación lineal para áreas superpuestas (Fig. 3e). Se identificó un factor de aumento de 1,17 (lugar de muestra/lugar de acoplamiento), probablemente debido a imperfecciones en la alineación de la óptica en el cabezal de sonda rediseñado, y su influencia en la superposición de las baldosas se tiene en cuenta durante la costura. En el paso final, se aplica un filtro de paso de banda FFT para eliminar cualquier estructura central restante de la imagen del mosaico (Fig. 3f). En el SI se proporciona información más detallada sobre el procesamiento de imágenes y las motivaciones de los parámetros elegidos.

Utilizando parámetros apropiados (p. ej., superposición en la costura de mosaicos), la estrategia de reconstrucción de imágenes que se muestra en la Fig. 3 se aplicó a todas las imágenes de sondas de fibra en este estudio, incluido el tejido de un órgano hueco que se presenta en la siguiente sección.

Los resultados presentados en las secciones anteriores han demostrado que la sonda de fibra, en combinación con el posprocesamiento de imágenes, produce imágenes multimodales de secciones delgadas de tejido con una alta calidad que representa la morfoquímica esperada del tejido. A continuación, nuestro objetivo es evaluar la capacidad del cabezal de sonda de fibra para obtener imágenes de grandes áreas de órganos huecos, es decir, muestras de más de 10 mm2, como se requiere durante, por ejemplo, la endoscopia. Para ello, se utilizaron como muestras de prueba un trozo de tejido del intestino delgado de un cerdo doméstico (Sus scrofa domestica) y una muestra nativa a granel de colon humano. El cabezal de la sonda se fijó mediante un conjunto mecánico adecuado, mientras que la muestra se podía mover en tres ejes con respecto a él mediante una plataforma motorizada. Con un sistema de este tipo, se puede lograr una adquisición confiable de imágenes en mosaico para visualizar la morfoquímica de grandes áreas superficiales del tejido.

La parte interna del intestino del cerdo, la capa mucosa, se elimina rutinariamente después del sacrificio como proceso previo a la siguiente producción de embutidos. La muestra se puso en solución salina tamponada con fosfato para evitar que se seque durante el escaneo de áreas grandes. El tiempo de adquisición para una sola imagen en las mediciones del intestino de cerdo fue de 32 s con una resolución digital de 2048 por 2048 píxeles, un tiempo de permanencia en píxeles de 2 µs y un promedio de 4 veces tanto para la imagen de la sonda como para la imagen LSM. Nuevamente, las imágenes se sobremuestrearon significativamente, lo que permitió reducir la resolución de los datos originales para emular el efecto de resoluciones de píxeles más bajas. Descubrimos que reducir la resolución de píxeles a 256 por 256 píxeles (correspondiente a un tiempo de adquisición de cuadros de ~ 0,5 s) no produce diferencias apreciables en el resultado final, además de una relación señal-ruido ligeramente menor (Fig. S3). Para cubrir un área grande del tejido intestinal, se registraron 390 imágenes (26 por 15 mosaicos, desplazamiento lateral de 190 µm) con la sonda y 77 imágenes (11 por 7 mosaicos, desplazamiento lateral de 550 µm) con el LSM y se recortaron en la muestra. área como se muestra en la Fig. 4b, c. Las líneas verticales brillantes en los límites de los mosaicos en la Fig. 4c son causadas por un artefacto debido a una ligera discrepancia en el tiempo del movimiento del espejo galvo durante el escaneo, lo que lleva a una discrepancia en la posición del núcleo en aquellas áreas que afecta negativamente la normalización. Para las mediciones masivas del colon humano, los tiempos de adquisición para imágenes individuales fueron de 8 sy 16 s con resoluciones de píxeles de 1024 por 1024 y 512 por 512, tiempos de permanencia de píxeles de 2 µs y 4 µs, y un promedio de 4 veces y un promedio de 16 veces para Fig. 4e, f, respectivamente. La imagen LSM (Fig. 4d) se tomó en un sistema LSM diferente (Zeiss LSM510, láser Ti:Sa (Coherent, EE. UU.) a 832 nm bombeado por láser CW de neodimio-vanadato, oscilador óptico paramétrico (APE, Alemania) a 672,5 nm. ) con objetivo Zeiss Plan-Apochroma 20×/0,8 NA, una resolución de píxeles de 1024 por 1024, un tiempo de permanencia de píxeles de 1,6 µs y un promedio de 8 veces. Las modalidades individuales se midieron sucesivamente en epidirección. La potencia del láser en la muestra fue de 40 mW para el haz de bomba (672,5 nm; TPEF, CARS) y 50/200 mW para el haz de Stokes (832 nm; CARS/SHG, respectivamente). Las imágenes del LSM y de la sonda del colon humano en masa se tomaron en diferentes posiciones. La imagen de la sonda en la Fig. 4c muestra altas contribuciones de las tres modalidades no lineales. La morfoquímica mostrada en estas imágenes multimodales se correlacionó, nuevamente, histológicamente con la tinción posterior con H&E. La Figura 4a muestra una imagen H&E transversal de la muestra de intestino de cerdo que se muestra en la Fig. 4c, junto con las principales características morfológicas de una pared intestinal para la conformación estructural de la muestra investigada. Normalmente, las muestras de intestino tienen cuatro capas distintas: mucosa, submucosa, túnica muscular y serosa. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el carnicero eliminó la mayor parte de la capa mucosa del intestino del cerdo. Por lo tanto, en nuestra muestra, la primera capa en la dirección de medición estaba compuesta principalmente por submucosa y posiblemente restos de mucosa, como se ve en la imagen H&E en la Fig. 4a. La submucosa incluye capas densas irregulares de tejido conectivo con vasos sanguíneos, linfáticos y nervios que se ramifican hacia la capa mucosa superior. En las imágenes de las figuras 4b, c se puede ver una combinación de una fuerte señal proveniente de lípidos (CARS en rojo) y colágeno (SHG en azul), que da como resultado un color violeta. Las señales intensas y colocalizantes de CARS y TPEF (amarillo) indican distintas acumulaciones de lípidos que son bien visibles en ambas imágenes. Las regiones de fuerte señal TPEF (verde) pueden originarse a partir de elastina en la submucosa y las capas musculares debajo de la submucosa. El parecido general de ambas imágenes es excelente, lo que indica que, a nivel de tejido, se puede obtener información equivalente.

(a) Imagen H&E de una sección de intestino delgado de cerdo cortada perpendicularmente a la superficie del intestino con asignaciones de capas histológicas. La flecha (negra) indica la capa medida (el resto de la mucosa y submucosa) para el LSM (b) y el registro de la sonda (c). (b) Imagen LSM de la superficie interna de una muestra de intestino de cerdo tomada en las proximidades de (a). (c) Imagen de la sonda de fibra después de la reconstrucción de la imagen. Tamaño de la baldosa: 207 × 207 µm2. Las áreas marcadas, roja en (b) y azul en (c), se amplían en tres canales separados para una comparación directa de la misma área. Las flechas blancas en las imágenes CARS de las vistas ampliadas indican un objeto parecido al polvo, lo que implica que la imagen de la sonda se tomó en un plano focal diferente, lo que genera un contraste morfológico ligeramente diferente al de la imagen LSM (b). (d) Imagen LSM de la superficie interna de un colon humano en masa. En el inserto, se superpuso una representación en escala de grises del canal SHG con brillo escalado individualmente para tener en cuenta las bajas intensidades, en comparación con las regiones azules en la imagen principal (30% de transparencia) para resaltar las estructuras de la cripta. (e) Imagen de sonda de fibra de la superficie interna de un colon humano en masa después de la reconstrucción de la imagen. (f) Imagen de sonda de fibra de la superficie interna del colon con capa mucosa desprendida. Tamaño de baldosa en (e) y (f): 235 × 235 µm2. Codificación de colores: rojo—CARS, azul—SHG, verde—TPEF.

La mayor parte del colon humano (Fig. 4d-f) todavía contiene la capa mucosa. En consecuencia, una imagen LSM (Fig. 4d) muestra las estructuras típicas de las criptas, como se ve en los canales CARS (rojo) y TPEF (verde). En cuanto a la muestra de intestino de cerdo, otra característica evidente en el canal CARS es la importante acumulación de lípidos. Si bien acumulaciones similares se distinguen fácilmente en la imagen de una sonda de fibra correspondiente (Fig. 4e, puntos rojos), la menor intensidad de la señal y el contraste en general tanto en CARS como en TPEF hacen que la identificación de las criptas (abajo a la izquierda) sea más difícil aquí. Las características celulares o subcelulares no son visibles en ninguna de las imágenes. En términos más generales, la relativa homogeneidad de la mucosa a bajas resoluciones en imágenes CARS/TPEF parece ser un factor limitante. Las estructuras en la submucosa y la túnica muscular que proporcionarían un fuerte SHG/TPEF están en su mayoría desenfocadas tanto en la imagen del LSM como de la sonda de fibra. Para demostrar que esto es un efecto de la morfoquímica del tejido en lugar de la sonda en sí, se registró otra imagen de la sonda de fibra en un área donde la mucosa se desprendió debido al estrés mecánico resultante del manejo de la muestra (Fig. 4f), mostrando la nitidez esperada. funciones en el canal TPEF y SHG. En general, y con las limitaciones discutidas, la Fig. 4 ilustra la capacidad de la sonda multimodal CARS/SHG/TPEF presentada para visualizar la morfoquímica de órganos huecos, lo que no se puede lograr mediante técnicas microscópicas convencionales, por ejemplo, endoscopia con luz blanca. Las imágenes multimodales muestran una alta conformidad morfológica y una calidad de imagen comparable en la mayoría de los aspectos a las imágenes obtenidas con un microscopio de barrido láser. No se observaron fotodaños inducidos por láser en las muestras después de la obtención de imágenes.

Estos resultados resaltan la aplicabilidad del diseño de sonda presentado a muestras médicamente relevantes, incluido específicamente tejido a granel. Sin embargo, es igualmente importante resaltar los pasos futuros que aún son necesarios hacia una configuración lista para aplicaciones para escenarios de casos de uso clínico. Estos pasos se pueden agrupar en pasos relacionados con software y hardware. Para el hardware se requiere una superficie fácil de limpiar en el extremo distal de la fibra. Como se describió anteriormente, para una creación de prototipos más sencilla y una mayor versatilidad en la fase de prueba, el diseño actual no incluye una ventana de vidrio fija y, en cambio, se basa en un cubreobjetos (170 µm) que se coloca sobre la muestra. Como esto limita la evaluación de un procedimiento operativo manual y requiere un control z preciso mediante un dispositivo mecánico, la siguiente iteración del diseño incluirá una ventana fija para la operación en condiciones de contacto. También está relacionada con las condiciones de funcionamiento portátil la velocidad de fotogramas actualmente alcanzable de aproximadamente 2 fps (tiempo de permanencia de 2 µs, 256 × 256 px; límite del dispositivo: ~ 8 fps en modo de escaneo unidireccional) manteniendo al mismo tiempo una buena calidad de imagen en comparación con las Figs. 1, 4 (ver también Fig. S3). Es deseable y técnicamente alcanzable mediante el uso de un escáner resonante velocidades de fotogramas más altas, es decir, de vídeo real, que eviten distorsiones de fotogramas durante las mediciones bajo movimiento continuo de la sonda o falta de superposición entre fotogramas y las incertidumbres resultantes en las posiciones relativas de los fotogramas. En la implementación actual, la velocidad de escaneo todavía está limitada por la potencia de salida del láser y la sensibilidad del detector, los cuales son direccionables y no están relacionados con el diseño de la sonda.

Por otro lado, la necesidad de realizar mediciones de múltiples fotogramas podría eliminarse parcialmente utilizando una fibra que garantice un mayor campo de visión, como la FIGHT-100-1500N disponible comercialmente de Fujikura, que tiene un diámetro de 1,5 mm y por lo demás parámetros idénticos a los del haz de fibras utilizado en este estudio. Actualmente, la costura de cuadros múltiples se lleva a cabo como un paso de posprocesamiento separado y se basa en la información posicional proporcionada por una platina de microscopio. Se encuentran disponibles sensores ópticos de posición con la precisión necesaria. Podrían integrarse relativamente fácilmente en el diseño, pero la unión en línea basada en software también se ha vuelto factible con hardware moderno. Las soluciones comerciales43 incluso tienen en cuenta los artefactos de movimiento y distorsión, aunque no del todo en línea. Dicha unión requiere una verdadera reconstrucción de imágenes en línea, que es nuestro enfoque actual con respecto a las mejoras basadas en software, ya que es estrictamente necesaria para el escenario de aplicación previsto. Estas cuestiones no son fundamentales y son técnicas, lo que da como resultado un camino claro para desarrollos futuros hacia un dispositivo de imágenes práctico para histopatología espectral en tiempo real que respete los requisitos clínicos.

Este estudio demostró el potencial de las sondas endoscópicas de fibra de imágenes no lineales de múltiples núcleos para aplicaciones clínicas. Se demostró que las imágenes multimodales CARS/SHG/TPEF de muestras de tejido a granel tomadas con dicha sonda detallan la morfoquímica de dichas muestras en resoluciones que satisfacen los requisitos del escenario de aplicación propuesto y al mismo tiempo muestran una excelente conformidad con las imágenes de referencia tomadas con un LSM convencional. Además, el diseño optimizado y la mejor calidad de ensamblaje en comparación con una implementación anterior32 mejoraron el rendimiento óptico, lo que resultó en una mejor iluminación y una mayor eficiencia en la recolección de señales. Si bien reconocemos que probablemente no habrá un único enfoque endoscópico de imágenes no lineales multimodales que sea el mejor para todas las aplicaciones y, por lo tanto, se debe impulsar el desarrollo técnico para todas las implementaciones del concepto, nuestros hallazgos hacen que las sondas de fibra multinúcleo sean una alternativa atractiva para las sondas rígidas. endoscopios, endoscopios de fibra de escaneo y sistemas microelectromecánicos o basados en espejos de escaneo galvo miniaturizados para aplicaciones clínicas. Específicamente, las sondas de fibra multinúcleo cambian un diseño totalmente óptico más simple, más resistente y potencialmente más seguro, sin piezas móviles ni portadoras de corriente, por un diámetro mayor, una menor transmisión de potencia láser y una pérdida de resolución como consecuencia de sus imágenes inherentemente pixeladas. .

Se demostró que los efectos de esta pixelización pueden mitigarse mediante procedimientos adecuados de procesamiento de imágenes. Además, el procedimiento de procesamiento utilizado en este estudio facilita la comparabilidad de diferentes áreas en la misma imagen y entre imágenes tomadas con diferentes sondas, lo que será relevante para trabajos futuros, especialmente en el contexto de una aplicación clínica. Finalmente, se discuten los próximos pasos técnicos para futuros desarrollos hacia dispositivos de imágenes prácticos para una serie de campos, incluidos la dermatología, la gastroenterología, la neurocirugía o la cirugía de cabeza y cuello. En combinación con algoritmos de análisis de imágenes adecuados, el diseño de sonda de fibra discutido puede establecer un enfoque histopatológico espectral rápido, conveniente y sin etiquetas sin la necesidad de extirpar tejido, evitando riesgos e inconvenientes potenciales inherentes a la histopatología clásica y, por lo tanto, basada en biopsia. enfoques.

La muestra nativa de colon humano y la muestra de cáncer de cabeza y cuello humanos se recibieron después de la cirugía del Hospital Universitario de Jena. Los sujetos dieron su consentimiento informado y el estudio fue aprobado por los comités de ética del Hospital Universitario de Jena. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes según la Declaración de Helsinki. La muestra de intestino de cerdo (Sus scrofa domestica) se adquirió comercialmente en una carnicería local (Fleischerei Hönnger, Jena).

La información de respaldo digital está disponible en línea e incluye una descripción detallada de todos los pasos de procesamiento de datos para la reconstrucción de imágenes, incluido un diagrama de flujo respectivo, un resumen de todos los parámetros de reconstrucción relevantes, una descripción detallada del algoritmo de reconstrucción, una descripción general del proceso de núcleo a -determinación de la distancia del núcleo, una comparación de la calidad de la imagen después de la reconstrucción para diferentes resoluciones digitales originales, detalles sobre la aproximación señal-ruido, una discusión de diferentes enfoques de depixelación y una discusión de las consideraciones de diseño con respecto a la diafonía entre núcleos y resolución. Además, el algoritmo de reconstrucción de imágenes está disponible como un archivo separado.

Los datos originales están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Orlando Guntinas Lichius

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Andreas Stallmach

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Preparación del manuscrito original: HB, MRTM-Z.; construcción del microscopio: HB; reconstrucción de imágenes y análisis de datos: RM; diseño óptico del cabezal de sonda: GM, BM; preparación de muestras e interpretación biomédica de resultados: ATP, MB, OG-L., AS; diseño de estudios, coordinación de proyectos, supervisión, revisión de manuscritos: TM-Z., MS, BM, JP; soporte y discusión de algoritmos de reconstrucción de imágenes: TB; Todos los autores han aprobado la versión final del manuscrito. HB y MR contribuyeron igualmente a este estudio.

Correspondencia a Juergen Popp.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Bae, H., Rodewald, M., Meyer-Zedler, T. et al. Estudios de viabilidad de endoscopia no lineal multimodal utilizando haces de fibras multinúcleo para escaneo remoto desde secciones de tejido hasta órganos en masa. Representante científico 13, 13779 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40944-6

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Recibido: 08 de junio de 2023

Aceptado: 18 de agosto de 2023

Publicado: 23 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40944-6

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