Una vía excitatoria monosináptica del tronco encefálico que impulsa las actividades locomotoras y las respuestas cardiovasculares simpáticas.

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 5079 (2022) Citar este artículo

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El ejercicio que incluye la locomoción requiere ajustes cardiovasculares autónomos apropiados para satisfacer las demandas metabólicas de los músculos en contracción; sin embargo, la arquitectura funcional del cerebro que subyace a estos ajustes sigue siendo desconocida. Aquí, demostramos circuitos del tronco encefálico que desempeñan un papel esencial en la transmisión de señales motoras volitivas, es decir, comando central, para impulsar actividades locomotoras y respuestas cardiovasculares simpáticas. Las neuronas locomotoras mesencefálicas en ratas transmiten señales excitadoras impulsadas por comandos centrales hacia la médula ventrolateral rostral al menos parcialmente a través de procesos glutamatérgicos, para activar los sistemas nerviosos somatomotor y simpático. La excitación optogenética de esta vía monosináptica provoca respuestas locomotoras y cardiovasculares como se observa durante el ejercicio de carrera, mientras que la inhibición de la vía suprime las actividades locomotoras y la elevación de la presión arterial durante la carrera voluntaria sin afectar la homeostasis cardiovascular basal. Estos resultados demuestran una importante vía subcortical que transmite señales de comando centrales, proporcionando una visión clave del mecanismo del circuito central requerido para el acondicionamiento fisiológico esencial para maximizar el rendimiento del ejercicio.

El ejercicio, incluida la locomoción, que forma parte del comportamiento fundamental de los vertebrados, incluidos los humanos, va acompañado de ajustes cardiovasculares autónomos que proporcionan los recursos metabólicos, como combustible y oxígeno, que demandan los músculos esqueléticos en contracción y, por tanto, aumentan el rendimiento físico. La contribución de una señal motora descendente procedente del prosencéfalo al control cardiovascular se ha sugerido durante más de un siglo1,2. Actualmente, esta señal de retroalimentación se ha denominado comando central y se ha postulado como una activación paralela de los sistemas motores somáticos y autónomos en el cerebro para aumentar simultáneamente la actividad muscular junto con la presión arterial y la contractilidad cardíaca3. Este concepto surgió por primera vez de un estudio en humanos que mostró que la magnitud de las respuestas cardiovasculares durante el ejercicio isométrico voluntario con tensión muscular constante se correlacionaba positivamente con la cantidad de activación del comando central que cambiaba por las contracciones reflejas debido a la vibración del tendón en el músculo agonista o antagonista4. El comando central está acoplado a la activación del sistema nervioso simpático independientemente de la retroalimentación del movimiento, como lo demuestran los aumentos en las variables cardiovasculares durante la locomoción ficticia en gatos decorticados y paralizados5 y por las respuestas cardiovasculares exageradas a la contracción muscular voluntaria en sujetos humanos después de la parálisis6,7.

La ubicación precisa de la fuente del comando central aún no está clara porque el mecanismo del circuito central mediante el cual las señales de comando central provocan ajustes cardiovasculares autónomos durante el ejercicio aún no se ha dilucidado por completo. Las regiones autónomas del cerebro activadas en respuesta al ejercicio voluntario8,9,10,11,12 o regiones cuya estimulación provoca respuestas autónomas o somatomotoras13,14,15,16,17,18 pueden estar involucradas en el control central de la circulación. Por ejemplo, los estudios en humanos que utilizan técnicas neuroquirúrgicas sugirieron que los circuitos mesencefálicos, incluido el núcleo subtalámico (STN) y la sustancia gris periacueductal (PAG), cuyas actividades neuronales se elevan durante el ejercicio volitivo11, configuran circuitos subcorticales para transmitir señales de comando centrales19, como lo demuestra el efecto presor de Estimulación eléctrica del STN17 o PAG18 dorsal/lateral en pacientes despiertos con enfermedad de Parkinson o dolor crónico. Sin embargo, no se ha demostrado el papel causal de estas regiones del cerebro en los cambios autonómicos durante el ejercicio, así como en las conexiones funcionales con otras regiones. El sustrato cerebral del mando central también ha adquirido importancia clínica. La regulación cardiovascular anormal durante el ejercicio en condiciones patológicas, como la insuficiencia cardíaca, aumenta la intolerancia al ejercicio y el riesgo de eventos cardíacos fatales como la arritmia20. Esto se debe, al menos en parte, a una disfunción del comando central21,22, mientras que los programas de ejercicio terapéutico para los pacientes mejoran su estado funcional y su resultado23.

La médula ventrolateral rostral (RVLM), que se encuentra inmediatamente caudal al polo caudal del núcleo facial, contiene neuronas premotoras simpáticas que se proyectan espinalmente, más de la mitad de las cuales son neuronas adrenérgicas C124. Tanto las neuronas RVLM C1 como las no C1 se excitan con el ejercicio voluntario8,9,12 y desempeñan un papel fundamental en la regulación del tono vasomotor simpático25,26,27,28. Por lo tanto, el RVLM es probablemente un nodo clave del mecanismo del circuito central para las respuestas cardiovasculares simpáticas durante el ejercicio29. En el presente estudio, para identificar una vía monosináptica subcortical que transmite señales de comando centrales al RVLM durante el ejercicio voluntario para provocar respuestas cardiovasculares, realizamos neuroanatomía funcional y experimentos fisiológicos in vivo en ratas para registrar descargas de nervios periféricos, cambios cardiovasculares y comportamientos en combinación con técnicas optogenéticas para manipular una vía de interés.

Primero buscamos neuronas que proyectan RVLM en ratas mediante rastreo retrógrado con el trazador, subunidad b de la toxina del cólera (CTb), inyectado unilateralmente en RVLM (Fig. 1a, b). Se encontró que un número significativo de cuerpos celulares neuronales marcados con CTb estaban distribuidos bilateralmente en áreas del mesencéfalo, incluido el núcleo cuneiforme (CnF) y el núcleo tegmental pedunculopontino (PPTg), este último albergaba muchas neuronas colinérgicas (Fig. 1c). Estos dos núcleos constituyen un área funcional conocida como región locomotora mesencefálica (MLR), que es capaz de iniciar y controlar la locomoción y está evolutivamente bien conservada en todas las especies de mamíferos, incluidos los humanos30,31. Por lo tanto, nos centramos en esta vía monosináptica MLR → RVLM como candidata para la ruta subcortical que media la señalización de comando central activada para el ejercicio locomotor. El MLR contiene neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas, además de neuronas colinérgicas PPTg, que envían bilateralmente numerosas proyecciones a lo largo de la formación reticular medular32. Sin embargo, muy pocas neuronas PPTg marcadas con CTb fueron inmunorreactivas para la colina acetiltransferasa (ChAT) (0,6 ± 0,3%, n = 3) (Fig. 1d). Por tanto, las neuronas MLR que proyectan RVLM son principalmente no colinérgicas.

a, b Inyección de CTb en el RVLM unilateralmente. TH tirosina hidroxilasa; IO núcleo oliva inferior; núcleo paragigantocelular lateral LPGi; Núcleo anbiguo de NA. Barra de escala: 1 mm. c Dibujo de la distribución de células marcadas con CTb [combinadas de 8 ratas (6 machos, 2 hembras)] y células inmunorreactivas con ChAT positivas o negativas para CTb [combinadas de 3 de 8 ratas (2 machos y 1 hembra)] en la sección coronal del mesencéfalo. acueducto aq; PAG gris periacueductal. d Imagen confocal que muestra que las células PPTg marcadas con CTb no se fusionaron con células inmunorreactivas con ChAT. Barra de escala: 50 μm. e, f Inyecciones de AAV-CMV-ChIEF-tdTomato en el MLR bilateralmente. Barras de escala: 1 mm (mesencéfalo) y 200 μm (ampliada). g tdAxones marcados con tomate distribuidos en la médula ventral. Barra de escala: 1 mm. h Imagen confocal que muestra asociaciones estrechas de hinchazones axonales marcadas con tdTomato que contienen VGLUT2 (puntas de flecha) con dendrita neuronal y cuerpo celular RVLM C1 (asterisco). Barra de escala: 10 μm. i Esquema experimental para estudiar las inmunorreactividades de Fos en neuronas MLR que proyectan RVLM de ratas ejercitadas y no ejercitadas en cinta rodante. j Tinción por inmunofluorescencia de GFP y Fos. Las puntas de flecha indican la expresión de Fos en células marcadas con GFP que se encuentran en PPTg. Barras de escala: 100 μm. k Comparaciones de células inmunorreactivas con Fos en neuronas MLR que proyectan RVLM marcadas con GFP entre controles no ejercitados y ratas ejercitadas (n = 7 para cada grupo distinto; todos machos). Los datos se analizaron mediante la prueba t de Welch bilateral; La información estadística, incluidos los valores del estadístico t y los grados de libertad, se presenta en la Tabla complementaria 15. Los datos mostrados son medias ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Las imágenes de la sección del cerebro utilizadas en las figuras (a, e, i) fueron adaptadas de “Paxinos G & Watson C. The rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6ª ed. (Ámsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)”.

Para rastrear anterógradamente la vía MLR → RVLM, realizamos inyecciones bilaterales en la región a través de CnF y PPTg con un vector de virus adenoasociado (AAV) que codifica ChIEF, una variante de canalrodopsina, fusionada con tdTomato (Fig. 1e, f). Los axones derivados de MLR marcados con ChIEF-tdTomato se distribuyeron abundantemente en la parte ventral de la médula (Fig. 1g); Además, las hinchazones axonales derivadas de MLR que contenían el transportador vesicular de glutamato 2 (VGLUT2) estaban estrechamente asociadas con los cuerpos celulares y las dendritas de las neuronas RVLM C1 (Fig. 1h), lo que sugiere que existe contacto sináptico entre las neuronas glutamatérgicas MLR → RVLM y las neuronas RVLM C1. . En general, estas observaciones indican que el RVLM recibe proyecciones bilaterales glutamatérgicas monosinápticas del MLR.

A continuación, cuestionamos si la vía MLR → RVLM se activa con el ejercicio de carrera. Investigamos la expresión de Fos, un correlato bioquímico del aumento de la activación, en neuronas de proyección MLR → RVLM después de correr voluntariamente en ratas que habían recibido inyecciones bilaterales de RVLM de un AAV retrógrado (AAVrg) que codifica EGFP; Estas ratas habían sido entrenadas para acostumbrarse al ejercicio voluntario en cinta rodante (Fig. 1i). De acuerdo con las observaciones de ratas inyectadas con CTb, la transducción AAVrg de neuronas proyectantes RVLM dio como resultado la localización densa de cuerpos celulares no colinérgicos marcados con EGFP en el MLR a través de CnF y PPTg (Figuras complementarias 1a, b). La carrera voluntaria en la cinta (16 m/min durante 40 min) aumentó la expresión de Fos en las neuronas MLR marcadas con EGFP (es decir, que proyectan RVLM), en comparación con el control sin ejercicio (Fig. 1j, k). Estos resultados indican que el ejercicio de carrera voluntario activa la vía MLR → RVLM, consistente con la noción de que esta vía monosináptica es parte del mecanismo del circuito central que media la señalización de comando central volitivo activada para el ejercicio de carrera.

También se observó un aumento de la expresión de Fos después del ejercicio en cinta rodante en neuronas PPTg inmunorreactivas con ChAT (Figuras complementarias 1c, d). Las neuronas PPTg colinérgicas excitadas pueden desempeñar un papel en la aceleración, pero no en la provocación, de la locomoción durante el ejercicio de carrera33.

Para estudiar el papel de las neuronas MLR → RVLM en la regulación cardiovascular autónoma, examinamos el efecto de la estimulación optogenética de las neuronas MLR → RVLM sobre la presión arterial (AP) y la frecuencia cardíaca (FC). En ratas anestesiadas con uretano, en las que las neuronas MLR expresaron ChIEF-tdTomato o palGFP (control) mediante inyecciones de AAV en el MLR (Fig. 1e-h), el RVLM se iluminó bilateralmente utilizando una luz láser azul pulsada de 5 ms (473 longitud de onda nm) con salida de 10 mW (cuando se activa continuamente) para fotoestimular los axones neuronales MLR → RVLM a través de fibras ópticas insertadas en el cerebro (Figura complementaria 2a). Una serie de pulsos a 20 o 40 Hz durante 2 minutos provocó consistentemente respuestas presoras y taquicárdicas en ratas que expresan ChIEF-tdTomato, pero no en controles que expresan palGFP (Fig. 2b, c complementaria). Estas observaciones indican que las neuronas MLR → RVLM excitadas provocan respuestas cardiovasculares autónomas, lo que nos llevó a examinar directamente el papel simpatoexcitador de la vía monosináptica MLR → RVLM con registro electrofisiológico de la actividad del nervio simpático renal (RSNA).

En ratas anestesiadas, en las que las neuronas proyectantes de RVLM expresaron canalrodopsina-2 (ChR2) marcada con GFP o EGFP de control mediante inyecciones bilaterales de AAVrg en RVLM (Fig. 1a, b complementaria), el MLR se iluminó bilateralmente para fotoestimular los cuerpos celulares. /dendritas de neuronas MLR → RVLM (dirigido a somas) de manera intermitente, es decir, mediante una serie de pulsos de 0,5 s (luz láser azul pulsada de 5 ms a 10, 20 o 40 Hz, salida de láser de 10 mW) con un intervalo de 1,5 s durante 1 min; Luego se examinaron los efectos de este procedimiento en RSNA (Fig. 2a). La fotoestimulación provocó una simpatoexcitación renal (RSNA) que fue sincrónica con cada serie de pulsos de iluminación de 0,5 s y estuvo acompañada por un aumento en la AP pero no en la FC durante el período de estimulación de 1 min (Fig. 2b). Los análisis de superposición y promedio de los cambios de RSNA durante 30 series de intervenciones (Fig. 2c) mostraron que la serie de pulsos a 10 o 20 Hz, pero no a 40 Hz, provocó significativamente una simpatoexcitación renal, que fue seguida por una rápida simpatoinhibición y un retorno a los niveles previos a la fotoestimulación. (Figura 2d). El componente simpatoexcitador en respuesta a la fotoestimulación a 40 Hz, según lo evaluado por el área bajo la curva (AUC) para los cambios en RSNA (Fig. 2c), fue un 29% menor que el de 20 Hz (P = 0,034, bilateral). prueba t pareada), tal vez debido a los efectos anestésicos, ya que la fotoestimulación a 40 Hz en ratas descerebradas no anestesiadas aumentó significativamente la RSNA a 20 Hz (descrito más adelante; Fig. 3). La anestesia con uretano podría amplificar el efecto de la inhibición recurrente reclutada por fotoestimulación de mayor frecuencia dentro del circuito simpatorregulador. Lo que indica la especificidad de las respuestas simpatoexcitadoras / simpatoinhibidoras provocadas por la estimulación optogenética de las neuronas MLR → RVLM, no se provocó ningún cambio de RSNA mediante la iluminación de las neuronas MLR que expresan EGFP y proyectan RVLM en ratas de control (Figura complementaria 3a).

a Estimulación optogenética de neuronas MLR → RVLM en ratas anestesiadas. Flechas: ubicación de las puntas de fibra óptica. b Registro representativo durante la estimulación optogenética (20 Hz) en una rata anestesiada que expresa ChR2-GFP. Los fondos de color azul agua indican períodos de iluminación. c Análisis de superposición y promedio realizado en RSNA que se muestra en el panel b. Los cursos de tiempo (grupos de 10 ms) de los cambios porcentuales en RSNA desde la línea de base (= valor promedio de 30 s antes de la primera intervención optogenética) durante cada ciclo (superior) se promediaron en cada punto temporal durante 30 intervenciones (inferior). d Cursos de tiempo (contenedores de 100 ms) de ∆RSNA, después de superponer y promediar el análisis, en respuesta a la estimulación neuronal intermitente MLR → RVLM en ratas anestesiadas que expresan ChR2-GFP [n = 9 (7 machos, 2 hembras) además de n = 7 (5 machos, 2 hembras) a 10 Hz]. e Efecto de los bloqueos del receptor de glutamato en RVLM sobre la respuesta de RSNA a la estimulación neuronal MLR → RVLM (20 Hz) en ratas macho anestesiadas que expresan ChR2-GFP (n = 6). Flechas: ubicaciones de puntas de pipeta para inyecciones de RVLM. Los datos se analizaron mediante RM ANOVA unidireccional de Friedman por rango (ya que no se pasó la prueba de normalidad o varianza igual) seguido de la prueba post hoc de Dunnett (d) o de una prueba t pareada bilateral (e). La información estadística, incluidos los valores estadísticos de F/t/χ2 y los grados de libertad, se presenta en la Tabla complementaria 15. *P <0,05 frente a la línea de base promediada de 30 s. #P <0,05 frente a valores promediados de 1 s inmediatamente antes de cada fotoestimulación en 30 intervenciones. Los valores de referencia para los paneles d y e se informan en las Tablas complementarias 2 y 4, respectivamente. Los datos mostrados son medias ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Las imágenes de la sección del cerebro utilizadas en las figuras (a, e) fueron adaptadas de “Paxinos G & Watson C. The rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6ª ed. (Ámsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)”.

a Estimulación optogenética de neuronas MLR → RVLM en ratas descerebradas no anestesiadas. b Una grabación representativa durante la estimulación optogenética (40 Hz) en una rata descerebrada que expresa ChR2-GFP. c, d Cursos de tiempo después de superponer y promediar el análisis (c intervalos de 100 ms) y durante las intervenciones optogenéticas (d intervalos de 10 s) de ∆RSNA y ∆VRNA en respuesta a una estimulación intermitente de 1 min de las neuronas MLR → RVLM en ChR2 -que expresan ratas macho descerebradas (n = 6). e Efecto de los bloqueos del receptor de glutamato en RVLM sobre las respuestas de ∆VRNA y ∆AP a la estimulación sostenida de 15 s de neuronas MLR → RVLM (40 Hz), evaluadas por sus valores integrados durante 15 s, en hombres descerebrados que expresan ChR2-GFP ratas (n = 6). Los datos se analizaron mediante RM ANOVA unidireccional/ANOVA RM unidireccional de Friedman por rango seguido de la prueba post hoc de Dunnett (c, d) o mediante una prueba t pareada bilateral (e). La información estadística, incluidos los valores estadísticos de F/t/χ2 y los grados de libertad, se presenta en la Tabla complementaria 15. *P <0,05 frente a la línea de base promediada de 30 s. #P <0,05 frente a valores promediados de 1 s inmediatamente antes de cada fotoestimulación en 30 intervenciones. Los valores de referencia para los paneles (c, d) y (e) se informan en las Tablas complementarias 5 y 7, respectivamente. Los datos mostrados son medias ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. La imagen de la sección del cerebro utilizada en la figura (a) fue adaptada de “Paxinos G & Watson C. The rat Brain in Stereotaxic Coordinates”. 6ª ed. (Ámsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)”.

Debido a que las neuronas MLR → RVLM expresan VGLUT2 en sus terminales axonales (Fig. 1h) y muchas neuronas RVLM expresan receptores de glutamato ionotrópicos, examinamos si la transmisión glutamatérgica en RVLM contribuye a la simpatoexcitación mediada por neuronas MLR → RVLM. La respuesta de RSNA a la estimulación optogenética intermitente de 1 minuto (a 20 Hz) de las neuronas MLR → RVLM se probó 10 a 20 minutos después de inyecciones bilaterales en el RVLM con solución salina (50 nl) o una mezcla de ácido 2-amino-5-fosfonovalérico. y cianquixalina (AP5/CNQX; 10 mM en solución salina; 50 nL). En comparación con el tratamiento con solución salina, el tratamiento con AP5/CNQX condujo a una disminución del 23% de la respuesta RSNA provocada optogenéticamente, según lo evaluado por los valores de AUC para los cambios de RSNA (Fig. 2e; Fig. complementaria 3b). A los 60 minutos después del tratamiento con AP5/CNQX, la respuesta de RSNA se recuperó al 90% de la que se obtuvo después de los tratamientos con solución salina (P = 0,58; prueba t pareada bilateral). En conjunto, estos resultados indican que la transmisión glutamatérgica en RVLM contribuye a la señalización MLR → RVLM que impulsa la simpatoexcitación renal.

Dado que las neuronas glutamatérgicas MLR desempeñan un papel importante en la evocación de la locomoción33,35,36,37, nos preguntamos si la excitación de las neuronas MLR → RVLM provoca no sólo la excitación simpático sino también la excitación de las motoneuronas, es decir, la activación del comando central. Para investigar esta posibilidad, registramos simultáneamente descargas en fibras nerviosas eferentes simpáticas periféricas y somatomotoras en ratas descerebradas, no anestesiadas y paralizadas. En esta preparación, mientras que la pérdida de inhibición de los circuitos corticotalámicos conduce a una hiperactividad del tronco encefálico, es ventajoso que se puedan descartar los efectos de la anestesia y la retroalimentación del movimiento. Las ratas descerebradas, en las que las neuronas proyectantes de RVLM expresaban ChR2-GFP, recibieron pulsos de láser en el MLR unilateralmente de manera intermitente durante 1 minuto como se indicó anteriormente (salida de láser de 20 mW; Fig. 3a). La estimulación optogenética de las neuronas MLR → RVLM elevó la AP sin efectos significativos sobre la FC y aumentó las descargas en las fibras nerviosas de la raíz ventral L5 simpática renal y somatomotora 38 (Fig. 3b). En particular, la forma de descarga de estas fibras nerviosas durante las intervenciones optogenéticas fue diferente; La simpatoexcitación renal (RSNA) se provocó de forma inmediata y sincrónica con cada serie de pulsos de iluminación de 0,5 s, mientras que la actividad del nervio de la raíz ventral (VRNA) se elevó gradualmente y se mantuvo a lo largo de intervenciones de 1 minuto (Fig. 3b-d). Los aumentos sostenidos en VRNA son consistentes con los de estudios previos, que examinaron el efecto de la estimulación eléctrica del MLR en ratas21 y gatos descerebrados39. Tales diferencias en las características de las respuestas de descarga neuronal simpática y somatomotora sugieren que los circuitos meduloespinales entre las neuronas MLR → RVLM y las neuronas motoras espinales desempeñan un papel como filtro de paso inferior, mientras que distintos circuitos meduloespinales aguas abajo de la vía MLR → RVLM median la rápida respuesta simpática. respuestas nerviosas. En contraste con la activación mediada por ChR2 de los flujos de salida motores simpáticos y somáticos, la iluminación en los controles que expresan EGFP no provocó cambios en el VRNA (Figuras complementarias 3c, d).

Utilizando ratas descerebradas, también probamos si la excitación de las motoneuronas y las respuestas cardiovasculares provocadas por la estimulación de las neuronas MLR → RVLM implican una neurotransmisión glutamatérgica en el RVLM. Las inyecciones bilaterales de AP5/CNQX en RVLM redujeron significativamente la activación de VRNA y la elevación de AP en respuesta a la fotoestimulación sostenida de 15 s de las neuronas MLR → RVLM en un 64 y un 34 % (evaluado mediante la integración de los cambios de VRNA y AP durante la estimulación de 15 s). período), respectivamente, en comparación con aquellos después de inyecciones de solución salina (Fig. 3e; Fig. complementaria 3e). Las respuestas de VRNA y AP se recuperaron 60 minutos después del tratamiento con AP5/CNQX en un 105 y un 81 % de las respuestas después del tratamiento con solución salina (P = 0,62 y 0,16; prueba t pareada bilateral; n = 3), respectivamente. Por el contrario, la estimulación optogenética no tuvo ningún efecto sobre la FC (Figura complementaria 3e). En conjunto, las neuronas MLR → RVLM excitadas aumentan concomitantemente los tonos vasoconstrictores simpáticos y somatomotores, en parte a través de la transmisión glutamatérgica en el RVLM.

La activación impulsada por la vía MLR → RVLM de los sistemas nerviosos simpático y somatomotor nos llevó a investigar si la estimulación de esta vía provoca tanto actividades locomotoras como cambios cardiovasculares autónomos como se observa en el ejercicio de carrera. Las ratas en las que las neuronas proyectantes de RVLM expresaban ChR2-GFP o controlaban EGFP mediante inyecciones bilaterales de AAVrg en el RVLM se sometieron a iluminación MLR a través de fibras ópticas y su AP se monitorizó con un telémetro de presión en condiciones de libre movimiento. Se colocaron ratas conscientes en una pista circular (ID100 y OD140 cm), y cuando descansaban pero no dormían ni se movían (p. ej., aseándose), los cuerpos celulares de las neuronas MLR → RVLM se iluminaron bajo registros continuos de AP, FC y comportamientos. (Figuras 4a-c).

a Estimulación optogenética de neuronas MLR → RVLM en ratas conscientes que se dejan libres para moverse en una pista circular. b Transducción de GFP en las fibras axonales de la médula de una rata que expresa ChR2-GFP (autofluorescencia). Barras de escala: 1 mm. c Células inmunorreactivas GFP y ChAT en el mesencéfalo. Asteriscos: ubicación de la punta de fibra óptica implantada. Barras de escala: 1 mm. d Grabación representativa durante una intervención optogenética sostenida de 15 segundos (40 Hz; 20 mW) en una rata consciente que expresa ChR2-GFP. e El curso del tiempo (grupos de 3 s) cambia en respuesta a una estimulación optogenética sostenida de 15 s (n = 8, además de n = 7 para estimulación bilateral, todos hombres). Los trazados de cada rata se presentan en la figura complementaria 4a. f Grabación representativa durante intervenciones optogenéticas intermitentes repetidas cinco veces (láser de 5 s encendido/láser de 5 s apagado) (40 Hz; 20 mW) en una rata consciente que expresa ChR2-GFP. Flechas: desconexión de señales de telemetría. Este registro se incluyó en los resultados porque la desconexión se produjo después de intervenciones optogenéticas. g El curso del tiempo (grupos de 5 s) cambia durante estimulaciones optogenéticas repetidas cinco veces (n = 8, además de n = 7 para estimulación bilateral). Los trazados de cada rata se presentan en la figura complementaria 4c. Los datos se analizaron utilizando RM ANOVA unidireccional/ANOVA RM unidireccional de Friedman por rango seguido de la prueba post hoc de Dunnett [e, g]. La información estadística, incluidos los valores estadísticos de F/t/χ2 y los grados de libertad, se presenta en la Tabla complementaria 15. *P <0,05 frente a la línea de base promediada de 15 s. Las vistas aéreas durante las grabaciones que se muestran en los paneles (d) y (f) se presentan en las Películas complementarias 1 y 2, respectivamente. Los valores de referencia para los paneles (e) y (g) se informan en las Tablas complementarias 8 y 9, respectivamente. Los datos mostrados son media ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. La imagen de la sección del cerebro utilizada en la figura (a) fue adaptada de “Paxinos G & Watson C. The rat Brain in Stereotaxic Coordinates”. 6ª ed. (Ámsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)”.

La iluminación unilateral de los cuerpos celulares de las neuronas MLR → RVLM que expresan ChR2-GFP durante 15 s con luz láser azul pulsada a 40 Hz (salida láser de 20 mW) aumentó inmediatamente la AP y provocó taquicardia tardía. Durante el período de estimulación, la fotoestimulación también provocó la locomoción de todo el cuerpo o la carrera sin impedir la capacidad de frenar o girar (Fig. 4d, e; Fig. 4a complementaria; Película complementaria 1). Además, las intervenciones optogenéticas unilaterales repetidas cinco veces en las que un ciclo consistía en 5 s de encendido y 5 s de apagado del láser a 40 Hz (20 mW) también provocaron respuestas presoras y respuestas taquicardiacas y locomotoras posteriores, que fueron fielmente sincrónico con cada serie de pulsos de iluminación de 5 s (Fig. 4f, g; Fig. complementaria 4c; Película complementaria 2). Las distancias que las ratas caminaron/corrieron y las respuestas cardiovasculares durante estas fotoestimulaciones (evaluadas mediante integración durante el período de estimulación) dependieron de la frecuencia entre 10, 20 y 40 Hz (a 20 mW) y de la intensidad entre 10, 20 y 35-40. mW (a 40 Hz) (Figura complementaria 4b, d). La estimulación optogenética bilateral provocó respuestas locomotoras y cardiovasculares similares a las causadas por la estimulación unilateral (Fig. 4e, g). Sin embargo, la iluminación MLR en los controles que expresan EGFP no provocó locomoción ni cambios cardiovasculares (Figura complementaria 5). Estos resultados demuestran que las neuronas MLR → RVLM excitadas impulsan tanto la locomoción como las respuestas cardiovasculares, lo que respalda la noción de que las señales de comando centrales transmitidas a través de la vía MLR → RVLM desempeñan un papel en la coordinación de los movimientos locomotores de las extremidades y los controles cardiovasculares autónomos necesarios para el ejercicio de carrera.

La estimulación optogenética de los cuerpos celulares neuronales MLR → RVLM no provocó taquicardia en ratas anestesiadas o descerebradas (Figs. 2, 3), probablemente porque la RVLM controla predominantemente la actividad vasomotora simpática en lugar de las funciones cardíacas25,26,27,28. Mientras tanto, esta estimulación en ratas conscientes aumentó la FC (Fig. 4). La respuesta taquicardia podría ser secundaria a la respuesta locomotora. La activación del reflejo basado en el músculo esquelético (es decir, reflejo presor del ejercicio) debido al movimiento o la contracción de los músculos de las extremidades en ratas conscientes debería estar involucrada en la respuesta de la FC40. También es probable que la estimulación de la vía MLR → RVLM active posteriormente otros circuitos centrales que a su vez provoquen respuestas cardiovasculares. Por ejemplo, el MLR regula el estado cortical en paralelo con la locomoción41.

También examinamos si otra vía simpatoexcitadora que proyecta RVLM media la locomoción. El núcleo paraventricular hipotalámico (PVN) contiene una gran cantidad de neuronas que proyectan RVLM, de las cuales la estimulación selectiva en ratas anestesiadas provoca simpatoexcitación42. Descubrimos que la estimulación optogenética de la vía PVN → RVLM en ratas conscientes y que se movían libremente aumentó la AP pero nunca provocó la locomoción (Figura complementaria 6). Por lo tanto, a diferencia de la vía MLR → RVLM, la vía simpatoexcitadora PVN → RVLM no participa en el control motor somático de la locomoción.

Para examinar la necesidad de neuronas MLR → RVLM en la integración motora somático-autonómica para las actividades locomotoras, probamos si la inhibición de esta vía durante el ejercicio de carrera voluntaria atenúa tanto la actividad locomotora como las respuestas cardiovasculares. Para inhibir optogenéticamente las neuronas MLR → RVLM, combinamos el sistema de expresión dependiente de Cre con AAV anterógrados y retrógrados para transducir selectivamente las neuronas MLR → RVLM con una canalrodpsina iChloC conductora de cloruro fusionada con mCherry o controlar eYFP; Luego, el MLR se iluminó bilateralmente con pulsos de láser azul43 (Fig. 5a). iChloC-mCherry o eYFP se expresó en 79 ± 5% de las neuronas MLR que expresan Cre (n = 10 ratas, en las que la inmunotinción de Cre fue exitosa; Fig. 5b). Los axones marcados con iChloC-mCherry / eYFP se distribuyeron abundantemente en el RVLM, en el que las terminales axonales se oponían a las neuronas RVLM C1 (Fig. 5c), lo que sugiere contactos sinápticos entre las neuronas MLR → RVLM marcadas y las neuronas RVLM C1.

a Inhibición optogenética de las neuronas MLR → RVLM de ratas conscientes libres para moverse en una jaula que contiene una rueda de platillo volante. b Expresión de iChloC-mCherry dependiente de Cre en neuronas MLR → RVLM. Asterisco: ubicación de la punta de la fibra óptica. Barras de escala: 1 mm (izquierda); 20 µm (derecha). c Distribución de axones inmunorreactivos de mCherry en la médula (izquierda); las hinchazones eran muy opuestas a las dendritas neuronales y cuerpos celulares de RVLM C1 (asteriscos; derecha). Barras de escala: 1 mm (izquierda); 10 µm (derecha). d Velocidad locomotora representativa y cambios cardiovasculares en respuesta a una inhibición optogenética de 2 s durante la rueda en marcha en una rata que expresa iChloC-mcherry. WRR, tasa de rotación de la rueda. La vista aérea durante la grabación se informa en la Película complementaria 3. El curso del tiempo (bins de 200 ms) cambia en respuesta a una intervención optogenética de 2 s durante la carrera en controles que expresan eYFP (n = 4) y ratas macho que expresan iChloC-mCherry (n=7). Gris, datos individuales promediados durante las pruebas. f Comparaciones entre controles (45 ensayos/4 ratas) y ratas que expresan iChloC-mCherry (96 ensayos/7 ratas): ∆WRR y ΔMAP integrados durante 5 s después del inicio de la intervención optogenética de 2 s durante la carrera. El nivel de preiluminación se determinó como un valor medio durante el período de 2 segundos inmediatamente antes de la iluminación láser. Barras horizontales, valores medios. g Gráficas de ∫ ΔMAP vs. ∫ΔWRR en cada prueba de carrera. Muchas parcelas de ratas que expresan iChloC-mCherry se distribuyen en el tercer cuadrante. h Comparaciones de porcentajes de prueba entre controles y ratas que expresan iChloC-mCherry y entre patrones de ∫ ΔWRR y ∫ ΔMAP. i Comparación entre controles (39 ensayos/4 ratas) y ratas que expresan iChloC-mCherry (69 ensayos/7 ratas) de ∫ ΔMAP en reposo. Los datos se analizaron mediante ANOVA RM unidireccional seguido de la prueba post hoc de Holm-Sidak o ANOVA RM unidireccional de Friedman por rango seguido de la prueba post hoc de Dunnett (e), prueba t de Welch bilateral (f), prueba bidireccional. RM ANOVA seguido de la prueba de Tukey (h) o la prueba U de Mann-Whitney (i). La información estadística que incluye los valores estadísticos de F/t/χ2 y los grados de libertad se presenta en la Tabla complementaria 15. *P <0,05 frente al nivel de preiluminación promedio de 2 s inmediatamente antes de la intervención optogenética (e). †P < 0,05 frente a todos los demás ensayos en cada grupo (h). ‡P < 0,05 frente a controles en cada patrón (h). Los valores de referencia para los paneles (e – h) y (i) (= nivel de preiluminación) se informan en las Tablas complementarias 13 y 14, respectivamente. Los datos mostrados son medias ± SEM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. La imagen de la sección del cerebro utilizada en la figura (a) fue adaptada de “Paxinos G & Watson C. The rat Brain in Stereotaxic Coordinates”. 6ª ed. (Ámsterdam, Academic Press/Elsevier, 2007)”.

A las ratas conscientes que estaban equipadas para manipulación optogenética y mediciones telemétricas de AP se les permitió moverse libremente en una jaula en forma de cubo [45 × 45 × 40 (alto) cm] que contenía una rueda horizontal con un diámetro de 36 cm (Fig. 5a). . Durante la carrera espontánea sobre la rueda o en reposo en el suelo de la jaula, el MLR se iluminó bilateralmente durante 2 s con un láser pulsado de 50 ms (10 mW a 10 Hz)43. Se confirmó que este enfoque optogenético inhibe eficazmente la excitación neuronal MLR → RVLM mediante tinción inmunohistoquímica de Fos. La expresión de Fos se indujo en neuronas MLR → RVLM mediante la activación optogenética mediada por ChR2 de sus cuerpos celulares bajo anestesia, y esta expresión de Fos inducida se suprimió mediante la fotoactivación simultánea de iChloC en estas neuronas (Figura complementaria 7).

En cada rata con expresión de iChloC-mCherry o control de eYFP en neuronas MLR → RVLM, se realizaron experimentos durante 2 a 4 días, en los que la serie de pulsos láser recibió en total 9 a 17 pruebas durante la carrera y 5 a 15 pruebas en reposo. . Las intervenciones optogenéticas durante la carrera voluntaria de la rueda fueron seguidas por varios patrones de cambios de comportamiento, como volver a correr después de detener/reducir la velocidad o pararse en la rueda después de dejar de correr, entre los ensayos en cada rata (Figura complementaria 8a; Película complementaria 3). Sin embargo, la probabilidad de que encontráramos el comportamiento de "recorrer" el período de 5 segundos después del inicio de la serie de pulsos láser de 2 s fue del 79 % (50–100 %, n = 4) para los controles que expresaban eYFP, pero solo 14 % (0–33%, n = 7) para ratas que expresan iChloC-mCherry (Figura complementaria 8b). Por el contrario, las probabilidades de que la actividad locomotora se suprimiera durante el período de 5 s fueron mayores para las ratas iChloC que para los controles (Figura complementaria 8b); Se observó correr con una pausa o desaceleración dentro del período de 5 segundos en el 37% (13–57%) de las pruebas de carrera para ratas iChloC, mientras que este patrón de comportamiento no se observó en ningún control. Se observó “pararse sobre la rueda después de dejar de correr” 5 s después del inicio del pulso láser en el 7% (0–21%) de los controles, pero en el 24% (14–35%) de las ratas iChloC. Además, se observó dejar la rueda por el piso de la jaula dentro del período de 5 segundos en 8-30% de las pruebas para seis de 7 ratas iChloC, mientras que 3 ratas de control nunca mostraron este comportamiento, además de un control que dejó la rueda en el 29% de las pruebas. los juicios.

Al promediar los cambios en la velocidad de rotación de la rueda (WRR) y los cambios cardiovasculares en todas las pruebas de carrera para cada rata, encontramos que la inhibición optogenética de las neuronas MLR → RVLM durante la carrera de la rueda ejerció efectos inhibidores sobre la actividad locomotora y la elevación de AP sin afectar la FC (Fig. 5d-f). Dado que tanto las reducciones de WRR como de AP ocurrieron inmediatamente después del inicio de la iluminación y exhibieron una cinética de curso de tiempo similar en promedio (Fig. 5e; Fig. Suplementaria 8c), era poco probable que la locomoción suprimida fuera una causa de la reducción de AP o viceversa. Mientras tanto, en los controles que expresan eYFP, la serie de pulsos láser administrada durante la carrera no tuvo ningún efecto sobre la WRR o los cambios cardiovasculares en promedio (Fig. 5e yf, Fig. complementaria 8c). Finalmente, en el 20% (0-31%) de los ensayos con controles, pero en el 71% (62-82%) de las ratas iChloC, se observaron disminuciones concomitantes en WRR y AP después de la intervención optogenética, independientemente de los patrones de comportamiento (Fig. 5g yh). Estos resultados indican que la neurotransmisión MLR → RVLM media la señalización de comando central que participa en la coordinación de la actividad locomotora y los controles cardiovasculares simpáticos durante el ejercicio de carrera.

Por el contrario, las series de pulsos láser administradas mientras las ratas estaban en reposo no tuvieron ningún efecto sobre la AP o la FC ni en los controles ni en las ratas que expresaban iChloC-mCherry (Fig. 5i; Fig. complementaria 9). Por lo tanto, es poco probable que la vía monosináptica MLR → RVLM contribuya a la homeostasis cardiovascular basal.

Nuestros análisis neuroanatómicos funcionales y experimentos fisiológicos in vivo combinados con manipulación optogenética en ratas revelaron que las neuronas MLR transmiten señales excitadoras impulsadas por comandos centrales, al menos en parte glutamatérgicas, al RVLM que estimulan los flujos de salida tanto somatomotores como simpáticos durante el ejercicio voluntario. La estimulación optogenética de la vía monosináptica MLR → RVLM provocó respuestas locomotoras y cardiovasculares autónomas como se observa en el ejercicio de carrera. Además, la inhibición selectiva de la vía MLR → RVLM suprimió la actividad locomotora y redujo la respuesta presora durante la marcha voluntaria de la rueda, pero no afectó la homeostasis cardiovascular basal en condiciones de reposo. En general, estos hallazgos demuestran que la vía subcortical MLR → RVLM constituye un componente clave del mecanismo del circuito central que transmite señales de comando central volitivas y, por lo tanto, media la coordinación del control cardiovascular autónomo y el control somatomotor de las extremidades, que se requiere para mejorar el rendimiento de la locomoción. o ejercicio de carrera.

Junto con la vía MLR → RVLM, el RVLM también recibe proyecciones del PAG, como se muestra en la figura 1c. Aunque el PAG parece constituir otro circuito subcortical para el comando central19, se desconoce si las neuronas PAG que proyectan RVLM participan en la regulación autónoma durante el ejercicio y merecen más estudios.

Mientras que los sistemas de control somatomotor y autónomo se han considerado tradicionalmente dispares44, los comportamientos primitivos de los vertebrados, incluidos el ejercicio, la locomoción, la alimentación, el sueño, la reacción de lucha, huida o congelación y el reflejo del dolor, se caracterizan por sistemas de control somatomotor y autónomo coordinados. regulación autonómica45,46,47. Por lo tanto, la arquitectura funcional del cerebro probablemente subyace a la fina coordinación de las actividades somatomotoras y autónomas para conductas específicas, aunque su organización actualmente no se comprende bien. De posible relevancia para este circuito, los trazados transneuronales dobles en ratas revelaron la presencia de poblaciones neuronales con conexiones a sistemas motores tanto somáticos como simpáticos en regiones discretas de todo el cerebro48,49,50. Además, la estimulación eléctrica o química de un área del hipotálamo o del mesencéfalo provocó simultáneamente cambios somatomotores y cardiovasculares en animales y humanos13,14,15,17,18. Regiones que previamente han sido investigadas neuroanatómica o funcionalmente, como PVN50, MLR15,49, RVLM y el núcleo paragigantocelular lateral (LPGi) en la formación reticular medular caudal48 entre otras13,14,15,17,18,48,49,50, pueden participar en la integración motora somático-autonómica y con ello incidir en diferentes conductas. Sin embargo, no se han explorado los roles causales de estas regiones en los comportamientos, así como la conectividad cerebral subyacente a estos roles. En el presente estudio, identificamos la vía MLR → RVLM como un mecanismo central subyacente a la integración motora somático-autonómica para el ejercicio de carrera voluntaria. En consecuencia, nuestro estudio proporciona una visión clave de la arquitectura cerebral para el acondicionamiento fisiológico necesario para maximizar el rendimiento en el ejercicio.

La vía MLR → RVLM parece constituir una conexión clave a través de la cual las señales de comando central volitivas para la locomoción o el ejercicio de carrera voluntaria afectan los sistemas nerviosos somatomotor y simpático. Como lo demuestran los diferentes patrones de descargas nerviosas somatomotoras y simpáticas evocadas por la estimulación de las neuronas MLR → RVLM (Fig. 3b-d), las señales excitadoras de esta vía parecen impulsar distintas vías meduloespinales que se conectan con las motoneuronas espinales y las neuronas preganglionares simpáticas. Sin embargo, no está clara la organización intrínseca para vincular funcionalmente la vía MLR → RVLM con actividades locomotoras o respuestas cardiovasculares simpáticas. Sin embargo, nuestro estudio de rastreo indica que las neuronas postsinápticas a las que se dirige la vía glutamatérgica MLR → RVLM incluyen neuronas RVLM C1 (Figs. 1h y 5c), aunque las neuronas RVLM no C1 también pueden ser un objetivo de esta vía. Tanto las neuronas C1 como las no C1 del RVLM envían proyecciones axonales a las neuronas preganglionares simpáticas de la médula espinal24. Las señales de comando centrales a través de la vía MLR → RVLM probablemente aumentan los flujos vasomotores simpáticos a través de estas neuronas simpáticas premotoras RVLM.

Con respecto a la conectividad postsináptica de las neuronas MLR → RVLM para la regulación del sistema nervioso somatomotor, observamos que la locomoción no puede iniciarse mediante estimulación no selectiva de las neuronas RVLM en roedores conscientes51,52, y esta opinión también está respaldada por la ausencia de efecto de la simpatoexcitaotría PVN → RVLM Estimulación neuronal sobre el comportamiento de las ratas (Figura complementaria 6). Por lo tanto, la locomoción impulsada por las neuronas MLR → RVLM parece requerir la activación de una subpoblación especializada de neuronas RVLM, que está controlada específicamente por esta vía monosináptica e involucra los circuitos locomotores ejecutivos meduloespinales. Los intermediarios clave entre las neuronas MLR → RVLM y las neuronas locomotoras espinales pueden incluir neuronas glutamatérgicas LPGi. Capelli et al.35 demostraron que la ablación condicional de esta población neuronal suprimía la locomoción provocada por neuronas glutamatérgicas MLR en ratones transgénicos VGLUT2-Cre, lo que sugiere que las neuronas glutamatérgicas LPGi desempeñan un papel modulador en la sintonización positiva de la locomoción mediada por neuronas glutamatérgicas MLR. El RVLM investigado en nuestros experimentos se coloca continuamente caudolateralmente al LPGi investigado por Capelli et al. rostrocaudalmente situado en el borde caudal del núcleo facial según los datos morfológicos de los estudios anteriores35 y nuestros (basados ​​en la distribución de las neuronas C1 y las áreas del cerebro para la transducción de AAV/implantación de cánula óptica), así como el cerebro estándar de ratón y rata. atlas. Como tanto RVLM como LPGi son partes de la formación reticular medular, que se caracteriza por una estructura interconectada y una red expansiva de tractos, las neuronas MLR → RVLM pueden tener contactos sinápticos con una población neuronal RVLM específica que regula las neuronas glutamatérgicas LPGi y/u otras Neuronas locomotoras meduloespinales. También es posible que las neuronas LPGi que controlan la locomoción estén entremezcladas en la parte medial del RVLM; pueden estar controlados postsinápticamente por neuronas MLR → RVLM. En general, mientras que las señales de comando central que descienden a través de las neuronas MLR → RVLM regulan el sistema nervioso simpático mediante la activación de neuronas RVLM simpatorreguladoras, las señales pueden estimular colateralmente otra población neuronal RVLM, que a su vez activa una red de circuitos meduloespinales distinta que incluye el LPGi para la locomoción. Se requieren más investigaciones para determinar con precisión los mecanismos separados del circuito descendente de las neuronas MLR → RVLM para las actividades locomotoras y las respuestas cardiovasculares simpáticas.

La locomoción es representativa de diversos comportamientos voluntarios, incluidos el escape, la persecución y la exploración, que son provocados por diferentes voliciones motoras. No está claro si la vía MLR → RVLM, que desempeña un papel esencial en el ejercicio de carrera voluntaria, también participa en otras conductas locomotoras. Sin embargo, la activación del MLR ciertamente contribuye a la locomoción para escapar53 y perseguir54. Caggiano et al.36 también sugirieron que las neuronas glutamatérgicas CnF que reciben proyecciones de la sustancia gris periacueductal apoyan la locomoción rápida necesaria para escapar, mientras que las neuronas glutamatérgicas PPTg, que reciben proyecciones de los ganglios basales, pueden ser necesarias para una locomoción exploratoria lenta. Por lo tanto, la vía MLR → RVLM puede constituir un nodo clave común que subyace al acoplamiento somatomotor-autonómico para estos tipos de comportamiento locomotor, aunque puede recibir entradas aferentes de distintos circuitos impulsados ​​por diferentes voliciones motoras. Aunque actualmente falta evidencia, los circuitos ascendentes que influyen en la actividad de las neuronas MLR → RVLM para el ejercicio de carrera voluntaria pueden incluir regiones cerebrales relacionadas con la motivación interna, como el sistema orexinérgico hipotalámico55 y/o el núcleo accumbens56, los cuales tienen proyecciones axonales hacia el MLR33,57. Además, aunque la estimulación del área motora suplementaria, el área premotora o la corteza motora provoca contracción muscular acoplada a la excitación simpática en sujetos humanos16, no hay información disponible sobre las conexiones corticales-subcorticales para transmitir señales de comando centrales. Además, mientras que se especula que el comando central se origina en el telencéfalo como “irradiación cortical”2, no hay consenso sobre el sitio que sirve como origen de las señales de comando central58. Los circuitos ascendentes que transmiten señales de comando centrales a las neuronas MLR → RVLM merecen una mayor investigación sobre los mecanismos cerebrales que subyacen a los ajustes cardiovasculares autónomos durante el ejercicio voluntario, un tema pendiente durante más de un siglo1,2 (Figura complementaria 10).

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal (ref#: 15-Y-40, 18-Y-11, 19-Y-53) y el Comité de Seguridad del Experimento de Recombinación Genética (ref#: 28-034, 31-067, 32-061) de la Universidad de Tottori. En este estudio se utilizaron ratas Sprague Dawley (Slc:SD; macho y hembra) de Japan SLC, Inc; fueron adquiridos en Shimizu Laboratory Supplier Co, Ltd y criados en nuestras instalaciones. Todas las ratas se mantuvieron en una habitación con aire acondicionado a 25 °C con un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h. Se alojaron en jaulas estándar, a excepción de las ratas para experimentos para estudiar el efecto de la inhibición optogenética mediante la activación de iChloC, que se alojaron (después del destete) en jaulas que contenían una rueda de platillo volante (36 cm de diámetro; Nutrición Exótica). Se puso a disposición agua y alimentos ad libitum. Todos los experimentos in vivo se realizaron en un laboratorio con aire acondicionado a 25 °C.

Los AAV para transducir anterógradamente neuronas MLR con ChIEF-tdTomato (AAV2/1-CMV-ChIEF-tdTomato) y con palGFP (AAV2/1-CMV-palGFP) bajo un promotor CMV (el casete del gen que codifica ChIEF-tdTomato fue donado por R McQuiston: Addgene#32846) y para la transducción dependiente de Cre de neuronas MLR → RVLM con iChloC-mCherry (AAV2/5-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry) (el casete del gen que codifica iChloC-mCherry fue donado por P. Hegemann: Addgene#85467) se han descrito previamente43,59,60. La producción y purificación de estos AAV siguió el protocolo central terapéutico y de focalización de transferencia genética modificado en el Instituto Salk (//vectorcore.salk.edu/protocols.php). Los plásmidos requeridos se transfectaron en células HEK293T y el AAV se purificó a partir de un lisado bruto de las células usando OptiPrep (Axis-Shield). Después de la concentración mediante un filtro de membrana (Amicon Ultra-15 NMWL 50 K, Merck), las valoraciones finales fueron 2,1 × 1011 GC/mL (AAV2/1-CMV-ChIEF-tdTomato), 3,5 × 1011 GC/mL (AAV2/1 -CMV-palGFP), y 3,4 × 1012 GC/mL (AAV2/5-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry). Todos los demás AAV se obtuvieron de Addgene (AAVrg-hsyn-EGFP, donado por B. Roth: Addgene#50465, 7,4 × 1012 GC/mL; AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP, donado por E. Boyden: Addgene# 58800, 8,0 × 1012 GC/mL; AAVrg-pgk-Cre, donado por P. Aebischer: Addgene#24593, 9,5 × 1012 GC/mL; AAV; AAV2-Ef1a-DIO-EYFP, donado por K. Deisseroth: Addgene# 27056, 3,0 × 1012 GC/ml; AAV5-EF1a-DIO-ChR2-eYFP, donado por K. Deisseroth: Addgene#35509, 1,0 × 1012 GC/ml). Los plásmidos y AAV con los números de Addgene proporcionados aquí se obtuvieron mediante acuerdos de transferencia de material con Addgene.

Se colocaron ratas (>6 semanas de edad) anestesiadas con 1-5% de isoflurano en oxígeno, intubadas y ventiladas artificialmente (SN480–7, Shinano) en una unidad principal estereotáxica (900LOS de David Kopf Instruments, Inc., o SR-6R de Narishige). Se inyectó CTb o la solución de AAV administrada en el sitio de interés del cerebro mediante el uso de un sistema de microinyección de presión calibrado (Nanoject II, Drummond Scientific Co.). Para las inyecciones en el RVLM, la superficie dorsal de la médula quedó expuesta mediante una incisión en la línea media realizada a través de la piel que cubre la parte posterior de la cabeza, seguida de una disección de los músculos que recubren la base del cráneo y luego una incisión realizada a través del atlanto. -membrana occipital. Las coordenadas para las inyecciones de RVLM (1,0 mm rostral y 1,8 mm lateral al cálamo scriptorius; 3,5 a 3,7 mm ventral a la superficie dorsal de la médula) correspondieron a las ubicadas aproximadamente caudalmente al polo caudal de los núcleos faciales. Para las inyecciones en el MLR (8,0 mm caudal, 2,0 mm lateral y 6,3–6,9 mm ventral al bregma), el cráneo se expuso mediante una incisión en la línea media de la piel y se hicieron dos orificios en el cráneo. Las soluciones inyectadas en el cerebro fueron las siguientes: CTb conjugado con Alexa-555 (1,0 mg/1 ml de PBS, C34776, Thermo Fisher Scientific) (23,0 nL × 4, RVLM), AAV-CMV-ChIEF-tdTomato (46,0 nL × 4, MLR), AAV-CMV-palGFP (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-EYFP (46,0 nL × 4, MLR), AAV-Ef1α-DIO-ChR2-eYFP (46,0 nL × 4, MLR), una mezcla de AAV-Ef1α-DIO-ChR2-eYFP y AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry (1:1, 46,0 nL × 4, MLR), AAVrg-hsyn-EGFP (23,0 nL × 3, RVLM), AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP (23,0 nL x 3, RVLM) y AAVrg-pgk-Cre (23,0 nL × 3 , RVLM). Después de las inyecciones, la micropipeta permaneció insertada durante 5 minutos antes de ser retirada.

En ratas inyectadas con CTb, se permitió un período de recuperación de 7 a 11 días hasta que fueron sometidas a perfusión transcardial. A las ratas inyectadas con AAV utilizadas en experimentos para examinar la expresión de Fos en las neuronas proyectantes de RVLM se les permitió un período de recuperación de 7 días antes de que comenzara el programa de entrenamiento con ejercicios en cinta rodante. En las ratas inyectadas con AAV utilizadas para experimentos optogenéticos en estados anestesiados o descerebrados, se permitió un período de al menos 14 días antes de los experimentos. Procedimientos de inyección de AAV para ratas en experimentos conscientes seguidos de una cirugía adicional para implantar intracranealmente cánulas de fibra óptica (diámetro del núcleo de 200 μm, CFML52U-20, Thorlab). Se insertaron verticalmente en el cerebro dos fibras ópticas para la iluminación bilateral del MLR (8,0 mm caudal, 2,0 mm lateral y 5,5–5,8 mm ventral al bregma) a través de dos orificios hechos en el cráneo y se aseguraron junto con los tornillos colocados. rodeando los agujeros usando cemento dental. Para la iluminación unilateral de la PVN, también se insertó verticalmente una fibra (1,9 mm caudal, 0,3 mm lateral y 7,9–8,2 mm ventral al bregma) y se aseguró. A las ratas utilizadas en experimentos conscientes se les permitió pasar más de 7 días antes de ser sometidas a otra cirugía para implantar un telémetro de presión inalámbrico para mediciones AP (TRM54P, Millar, Inc./Kaha Sciences), que se describe a continuación.

En ratas anestesiadas con isoflurano, intubadas y ventiladas mecánicamente, se realizó una incisión abdominal en la línea media para exponer la cavidad peritoneal y luego se realizó una disección roma para llegar a la aorta descendente. Durante la oclusión temporal de la aorta con una seda 2-0 en la bifurcación ilíaca y debajo de la bifurcación de la arteria renal izquierda, se insertó el sensor de presión del telémetro en la aorta, se avanzó 1-2 cm rostralmente y se fijó con malla quirúrgica y Pegamento quirúrgico biocompatible. Después de liberar la oclusión de la aorta, se cerró la incisión en la piel con sutura. Los experimentos en ratas conscientes se realizaron al menos una semana después de la implantación del telémetro.

Para estudiar inmunohistoquímicamente las excitabilidades de la vía MLR → RVLM mediante ejercicio de carrera voluntaria, ratas macho, que habían recibido inyecciones bilaterales en el RVLM con AAVrg-hsyn-EGFP, fueron entrenadas en cinta rodante 3 a 4 veces por semana y durante un total de 14 a 18 días. El primer día de entrenamiento, las ratas fueron colocadas en una cinta de correr hecha a medida con una rejilla de descarga eléctrica instalada en la parte trasera (MK-680C; Muromachi) durante al menos 30 minutos. Luego fueron sometidos a un ejercicio de carrera en cinta rodante a 10 m/min y una inclinación de 0˚ durante 1 min, al que siguió inmediatamente un período de 30 s de sonido de zumbador (1 Hz) como desencadenante del inicio del ejercicio. Esta sesión se repitió de 3 a 5 veces para que las ratas aprendieran la asociación entre el sonido del timbre y el inicio del ejercicio. Después del segundo día de entrenamiento, las ratas fueron sometidas a una sesión de carrera por día. La velocidad y la duración de la carrera se incrementaron gradualmente durante 10 días hasta 20 m/min y 40 min, respectivamente. Después de completar el ejercicio en cinta rodante a 20 m/min durante 40 minutos una vez, las ratas fueron sometidas a ejercicio de carrera en cinta rodante a 16 m/min durante 40 minutos durante las sesiones de entrenamiento restantes. Si el ritmo de carrera cayera por debajo del ritmo de la cinta durante cada sesión de entrenamiento, se proporcionaría a las ratas una estimulación eléctrica leve pero aversiva del pie con la rejilla de descarga. Sin embargo, las ratas recibieron muy pocas descargas porque recibieron un suave empujón con un hisopo de algodón cuando estaban a punto de tocar la rejilla. En consecuencia, estas ratas completaron el programa de entrenamiento y fueron capaces de correr voluntariamente en cinta rodante a 16 m/min durante 40 minutos sin recibir ninguna descarga o empujón. Se permitió un período de dos días sin entrenamiento entre el último día de entrenamiento y el día del protocolo.

El día del protocolo, las ratas fueron elegidas al azar como grupo de "Ejercicio" y "Control". Las ratas de ejercicio fueron llevadas a la cinta rodante, en la que nunca se habían administrado descargas en los pies, y mantuvieron un período de descanso de 15 minutos. Posteriormente, después del período de sonido del timbre durante 30 s, fueron sometidos a ejercicio en cinta rodante durante 40 minutos a 16 m/min. Los empujones fueron innecesarios durante este ejercicio en la cinta ya que las ratas corrieron durante todo el período sin acercarse a la parte trasera de la cinta. Las ratas de control no ejercitadas fueron llevadas a la cinta rodante pero no sometidas a ejercicio. Noventa minutos después de finalizar el ejercicio o el período de control, las ratas fueron anestesiadas profundamente mediante la inhalación de isoflurano al 5% en oxígeno y luego inmediatamente perfundidas transcardialmente (como se describe más adelante).

Para las cirugías para medir la actividad de los nervios periféricos y los parámetros cardiovasculares, la rata fue anestesiada con 1 a 5% de isoflurano en oxígeno, intubada y ventilada mecánicamente. Se cateterizaron la arteria y la vena femorales derechas para medir la AP mediante un transductor de presión (P23XL, Becton, Dickinson & Co.) y para infundir fármacos, respectivamente. Se colocaron dos electrodos de aguja en las extremidades anteriores para registrar el ECG a partir del cual se calculó la FC utilizando el tiempo entre ondas R sucesivas. La rata se colocó en la unidad principal estereotáxica. Para medir la RSNA, el riñón izquierdo se expuso retroperitonealmente a través de una incisión en el flanco izquierdo y luego se conectó un haz de fibras nerviosas renales a un electrodo bipolar hecho de alambre de acero inoxidable. Para medir el ARNV de L5, se realizó una laminectomía para exponer la porción lumbar inferior de la médula espinal y una incisión de las capas meníngeas que rodean la médula. El haz de nervios obtenido de la raíz ventral izquierda de L5 se aisló cuidadosamente y se colocó sobre un electrodo bipolar de acero inoxidable aislado y luego se cortó y ligó el haz distal al electrodo. Las descargas de la raíz ventral L5 reflejan actividades de las motoneuronas dirigidas al músculo esquelético de las extremidades posteriores61, ya que las raíces ventrales caudales a L3 en ratas no transportan axones de neuronas preganglionares simpáticas38. Las señales RSNA y VRNA se amplificaron utilizando un amplificador de CA (MEG-5200; Nihon-Kohden) con un filtro de baja frecuencia de paso de banda de 150 Hz y un filtro de alta frecuencia de 1 kHz para que fueran audibles. Los tejidos neurales expuestos se sumergieron en aceite mineral.

Las ratas para experimentos bajo anestesia recibieron administración intravenosa de uretano (600 mg/kg) y α-cloralosa (60 mg/kg). En ratas para experimentos en condiciones de descerebración sin anestesia, se ligaron arterias carótidas bilaterales para minimizar la hemorragia cerebral durante el procedimiento de descerebración. Después de una craneotomía parietal, el cerebro se seccionó coronalmente con una cuchilla a nivel precolicular. Se aspiraron todo el tejido neural rostral a la sección y los tejidos corticales que cubren el cerebelo.

Para entregar luz láser a la región objetivo, se utilizaron cánulas de fibra óptica, que se conectaron a un láser de estado sólido bombeado por diodo de longitud de onda de 473 nm (BL473T8-200; Shanghai Laser and Optic, Co.) controlado por un generador de impulsos ( SEN-7103; Nihon Kohden o STOmk-2; BRC Co.) a través de un cable de conexión de fibra óptica mono o ramificado se insertaron en el cerebro. Antes de la inserción, se midió la intensidad de salida del láser en la punta de cada cánula con un medidor (LPM-100; BRC Co.). Para la iluminación RVLM bilateral, se insertaron dos cánulas en el tronco del encéfalo en un ángulo vertical a la superficie dorsal del tronco del encéfalo (1,0 mm rostral y 1,8 mm lateral al cálamo scriptorius) con las puntas de las cánulas ubicadas a 3,0–3,2 mm rostroventral de la superficie. Para la iluminación del MLR, las puntas de las cánulas se insertaron perpendicularmente en el cerebro (8,0 mm caudal, 2,0 mm lateral y 5,5–5,8 mm ventral al bregma en ratas anestesiadas no descerebradas; 0,2–0,5 mm rostral y 2,0 mm lateral al borde de los colículos inferior y superior, y a 3,5 mm ventral a la superficie dorsal de los colículos en ratas descerebradas). Una vez completados todos los procedimientos quirúrgicos, se retiró el isoflurano a la rata. Se dejaron pasar al menos 60 minutos antes de que comenzaran los protocolos experimentales.

En ratas anestesiadas con uretano que respiraban espontáneamente y que habían recibido inyecciones bilaterales en el MLR con AAV-CMV-ChIEF-tdTomato o AAV-CMV-palGFP, el RVLM se iluminó bilateralmente con láser a 20 o 40 Hz con pulsos de 5 ms durante 30 s. La potencia del láser se preestableció en 10 mW cuando se iluminaba continuamente. En ratas no anestesiadas anestesiadas con uretano o descerebradas que habían recibido inyecciones bilaterales en el RVLM de AAVrg-Syn-ChR2(H134R)-GFP o AAVrg-hsyn-EGFP, 1 min intermitente (iluminación de pulso de 0,5 s con un intervalo de 1,5 s ; 30 series) o se administró fotoestimulación sostenida de 15 s del MLR a 10, 20 o 40 Hz con un pulso láser de 5 ms (potencia de salida del láser de 10 mW en ratas anestesiadas y 20 mW en ratas descerebradas). Las ratas descerebradas fueron paralizadas preliminarmente mediante una infusión intravenosa de bromuro de pancuronio (0,5 mg/kg de peso corporal). Durante la recopilación de datos, la frecuencia de la ventilación mecánica se fijó en 70 respiraciones/min, que no estaba sincronizada con la de la fotoestimulación periódica (0,5 s con láser encendido y 1,5 s con láser apagado). Esto se llevó a cabo para aleatorizar el posible efecto del flujo simpático arrastrado por la inflación pulmonar sobre las respuestas de RSNA a la fotoestimulación periódica21,61. El orden de la frecuencia de estimulación fue aleatorio y se permitieron intervalos de al menos 10 min entre maniobras.

Una mezcla de antagonistas ionotrópicos del receptor de glutamato, ácido 2-amino-5-fosfonopentanoico (AP5; A5282; Merck) y 6-ciano-7-nitro-quinoxalina-2,3-diona soluble en agua (CNQX; ab120044; Abcam) (10 mM cada uno en solución salina) se inyectaron bilateralmente en el RVLM para inhibir la transmisión glutamatérgica en el RVLM. Las inyecciones se realizaron con el sistema de microinyección NANOJECT II por vía transcraneal a través de orificios hechos en el cráneo (12,5 mm caudal, 1,8 mm lateral y 10,5–10,8 mm ventral al bregma) o a través de la superficie dorsal de la médula como se indicó anteriormente. Después de las inyecciones bilaterales de solución salina o AP5/CNQX (46,0 nl/sitio), la duración de la fotoestimulación fue de 5 a 20 minutos.

Una vez completada la recopilación de datos, las cánulas y/o micropipetas de fibra óptica se insertaron y retiraron repetidamente del cerebro para crear cicatrices para la confirmación post hoc de las ubicaciones de las puntas. El nervio renal y el haz de raíces ventrales se cortaron entre el electrodo y el eje neural para medir el ruido de fondo de RSNA y VRNA, respectivamente. Las ratas fueron anestesiadas profundamente con una infusión intravenosa adicional de uretano y α-cloralosa o inhalación de isoflurano al 5% en oxígeno, después de lo cual se sometieron a perfusión transcardial como se describe más adelante.

Se sometieron a experimentos para observar cambios en AP, FC ( calculado a partir de ondas AP) y el comportamiento en un estado consciente cuando el MLR o PVN se iluminaron con láser a través de las cánulas. Antes del día experimental, se permitió a las ratas moverse libremente durante 1 a 1,5 h en una pista circular y acostumbrarse al entorno experimental. Los diámetros interior y exterior de la vía eran de 100 y 140 cm, mientras que las alturas de las paredes interior y exterior eran de 30 y 40 cm, respectivamente. La pared interior estaba hecha de polietileno envuelto en cloruro de polivinilo negro, mientras que la pared exterior estaba hecha de tablero acrílico transparente. El suelo de la pista estaba hecho de láminas de caucho de superficie lisa, de color verde oscuro o negro.

El día del experimento, las cánulas de fibra óptica para la iluminación MLR se conectaron a un láser de estado sólido bombeado por diodos de longitud de onda de 473 nm a través de un cable de conexión de fibra óptica mono o ramificado de 1,5 m, giratorio de fibra óptica 1 × 1. Junta y cable de conexión FC-FC. La potencia de salida del láser para la iluminación MLR se ajustó preliminarmente con otras cánulas de fibra óptica que tenían la misma eficiencia de transmisión láser que la de las cánulas implantadas. Se dejó que la rata consciente se moviera libremente en la pista circular y se permitieron al menos 30 minutos antes de que comenzaran los experimentos. En la rata en reposo (que no dormía ni se movía activamente, como caminar o arreglarse), el MLR se iluminó unilateral o bilateralmente con pulsos láser de 5 ms a 10, 20 o 40 Hz después de recopilar datos de referencia durante 15 s. Se administraron pulsos de luz de manera sostenida durante 15 s, o de manera intermitente de manera repetitiva cinco veces para un láser de 5 s con un intervalo de 5 s. En otras ratas utilizadas para estudiar el efecto de la excitación neuronal PVN → RVLM, el PVN también se iluminó unilateralmente con láser. En los casos en los que se produjo una desconexión de las señales de telemetría durante las intervenciones optogenéticas durante más de 1 s, los datos se descartaron. En los casos de desconexión durante> 1 s después de las intervenciones optogenéticas (p. ej., Fig. 4f), los datos se incluyeron en los análisis. En cada rata en un día experimental, se realizaron de 2 a 6 pruebas en orden aleatorio, y se permitieron intervalos de al menos 10 minutos entre las pruebas. Los días experimentales estuvieron separados por al menos 2 días.

Ratas macho o hembra anestesiadas con isoflurano que habían recibido inyecciones bilaterales en el RVLM con AAVrg-hsyn-EGFP y en el MLR con AAV-Ef1a-DIO-eYFP, AAV-Ef1a-DIO-ChR2-eYFP o una mezcla de AAV- Ef1a-DIO-ChR2-eYFP y AAV-Ef1a-DIO-iChloC-mcherry se ventilaron mecánicamente y se canularon a través de una vena femoral. Las puntas de fibra óptica se insertaron en el cerebro para iluminación MLR (4,5 mm ventral al bregma). Posteriormente, bajo anestesia con infusión intravenosa de uretano y α-cloralosa, el MLR se iluminó bilateral e intermitentemente (10 s encendido/10 s apagado, 90 veces) durante 30 minutos con un láser azul pulsado de 50 ms (10 mW, 10Hz). Cuarenta y cinco minutos después de apagar la iluminación, los animales fueron perfundidos transcardialmente con paraformaldehído al 4% y luego se tomó el cerebro para realizar tinción inmunohistoquímica para marcar la expresión de Fos como se describe a continuación.

Se alojaron en grupos ratas macho jóvenes (de 4 a 6 semanas de edad) en jaulas de vidrio acrílico que contenían una rueda de platillo volante de 36 cm de diámetro (Exotic Nutrition). En consecuencia, estuvieron dispuestos a correr espontáneamente sobre la rueda cuando fueron sometidos al estudio. Después de alcanzar la madurez (>9 semanas de edad), estas ratas recibieron inyecciones bilaterales en el MLR con AAV-Ef1α-DIO-iChloC-mCherry o AAV-Ef1a-DIO-EYFP y en el RVLM con AAVrg-pgk-Cre, y fueron implantados con cánulas de fibra óptica y un transmisor de telemetría (como se describe anteriormente). El experimento se realizó durante la fase de oscuridad. El día del experimento, las cánulas de fibra óptica se conectaron al láser mediante cables de conexión y junta giratoria, y la potencia de salida para la iluminación MLR se preestableció en 10 mW.

Después de dejar a la rata consciente deambular libremente en una jaula en forma de cubo hecha de vidrio acrílico [45 × 45 × 40 (alto) cm] que contenía la rueda del platillo volante, se dejó pasar un período de al menos 30 minutos antes de comenzaron los experimentos. Se instalaron cuatro pequeñas protuberancias en el borde de la rueda a intervalos regulares; estos eran levemente contactables con una barra que se colocó en la jaula y se conectó a un transductor de fuerza (FT03; Grass Instruments) mediante un resorte. En consecuencia, la velocidad de rotación de la rueda (WRR) se calculó con intervalos de tiempo entre los eventos de desarrollo de tensión debido a los contactos entre las protuberancias y la barra. Mientras la rata corría voluntariamente sobre la rueda o en reposo (sin dormir ni moverse, por ejemplo, acicalándose) en el suelo, el MLR se iluminó bilateralmente durante 2 s con pulsos de 50 ms a 10 Hz43. La iluminación durante la carrera comenzó al menos 2 s después del inicio de la carrera espontánea. En un día, se realizaron aleatoriamente de 5 a 13 pruebas en reposo o durante la carrera para cada rata con intervalos de al menos 5 minutos permitidos entre las pruebas. Los días experimentales para cada rata estuvieron separados por al menos dos días.

Las ratas anestesiadas profundamente con una infusión intravenosa adicional de uretano o la inhalación de isoflurano al 5% en oxígeno fueron perfundidas transcardialmente con solución salina heparinizada seguida de paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato 0,1 M (PBS; pH 7,4). Los cerebros se extrajeron, se fijaron posteriormente en el mismo fijador a 4 °C durante 2 h y luego se transfirieron a una solución de sacarosa al 30 % a 4 °C durante 24 a 48 h. Utilizando un criostato (CM1900, Leica, Wetzlar, Alemania o HM505 E, GMI, Ramsey, MN, EE. UU.), se produjeron secciones cerebrales coronales o sagitales de 30 μm de espesor.

Para la tinción por inmunofluorescencia, las secciones de tejido se lavaron en PBS (2 lavados x 10 min) y se incubaron en una solución de anticuerpos (PBS que contenía Triton X-100 al 0,3%, lambda carragenano 2,5 g/l, NaN3 200 mg/l, 10 ml/l). L suero de burro normal) durante 2 h a temperatura ambiente. Luego, las secciones se incubaron en una solución de anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, después de enjuagar las secciones en PBS que contenía Triton X-100 al 0,03 % (2 x 10 min), se incubaron en la solución de anticuerpo secundario en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente y luego se enjuagaron nuevamente en PBS ( 2 × 10 min) en la oscuridad. Finalmente, las secciones se montaron en portaobjetos y se cubrieron con un medio de montaje líquido (P36930; Thermo Fisher Scientific). Las imágenes digitales de las secciones teñidas se capturaron con un microscopio digital (BZ-9000 o BZ-X710; Keyence) o un microscopio confocal (LSM780; Carl Zeiss).

Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes: anti-tirosina hidroxilasa de pollo (1:500; ab76442, Abcam), anti-colina acetiltransferasa de cabra (1:100 o 1:200; AB144P, Merck), anti-GFP de cabra (1:1000 ; GTX26673, GeneTex, Irvine, CA, EE. UU.), anti-tdTomato de cabra (1:500; AB8181, Sicgen), anti-Cre Recombinasa de ratón (1:1000; MAB3120, Merck), anti-c-Fos de conejo (1: 400; 2250s, Cell Signaling Technology), anti-GFP de conejo (1:1000; A-6455, Invitrogen), anti-RFP de conejo (1:1000; 600-401-379, Rockland), anti-tirosina hidroxilasa de conejo (1 :1000; AB152, Merck), y transportador antivesicular de glutamato 2 de conejo (1:500; AF860, Frontier Institute). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios (especie huésped, burro): anti-pollo DyLight 405 (1:250; 703-475-155, Jackson ImmunoResearch), anti-pollo Alexa Fluor 488 (1:500; 703-545-155, Jackson ImmunoResearch), Alexa Fluor 405 anti-cabra (1:500; ab175665, Abcam), Alexa Fluor 488 anti-cabra (1:500; ab150129, Abcam), Alexa Fluor 555 anti-cabra (1:500; A-21432, Thermo Fisher Scientific o ab150130, Abcam), anti-ratón Alexa Fluor 488 (1:500, ab150109, Abcam), anti-ratón Alexa Fluor 555 (1:500; ab150106, Abcam), anti-conejo Alexa Fluor 488 (1: 500; A-21206, Thermo fisher Scientific o ab150073, Abcam) y anti-conejo Alexa Fluor 555 (1:500; ab150074, Abcam).

Para el mapeo y el recuento de células en el mesencéfalo, se estudiaron secciones coronales a 8,0 mm caudal desde el bregma. Los niveles rostrocaudales de las secciones se validaron con referencia a puntos de referencia apropiados, como el acueducto cerebral, la sustancia gris periacueductal, las raíces sensoriales del nervio trigémino, el pedúnculo cerebeloso superior y los núcleos del colículo superior e inferior. Se investigó en ocho ratas la distribución de células marcadas con CTb en el mesencéfalo. En tres de las ocho ratas, también se investigó la distribución de células inmunorreactivas con ChAT. Las células inmunorreactivas con ChAT y marcadas con CTb se mapearon en imágenes digitales de secciones originales antes de transcribirlas a secciones estándar proporcionadas por Paxinos y Watson62, nuevamente utilizando los puntos de referencia apropiados.

Para contar el número de células inmunorreactivas con Fos en poblaciones inmunorreactivas con GFP o ChAT en el MLR, se eligió un corte por rata al azar entre 2 y 4 cortes sucesivos. Las células inmunorreactivas se mapearon en imágenes digitales de secciones coronales originales como se describió anteriormente. El número de células mapeadas en CnF y PPTg, cuya extensión se definió de acuerdo con el atlas de cerebro de rata62 y con referencia a la distribución de células inmunorreactivas ChAT, así como puntos de referencia apropiados, se contaron bilateralmente de manera doble ciego. .

Las imágenes de la sección del cerebro utilizadas en las figuras (Figs. 1a, c, e, i, 2a, e, 3a, 4a, 5a, Figs. complementarias 2a, 6a, 7a, 10) se crearon con referencia a las ilustraciones de Paxinos y Watson. Atlas del cerebro de rata62.

A lo largo de los experimentos optogenéticos in vivo, todas las mediciones analógicas se digitalizaron mediante el sistema de adquisición de datos del convertidor AD (PowerLab 8/30 u 8/35; ADInstruments), se mostraron continuamente en un monitor de computadora y se registraron digitalmente a una frecuencia de muestreo de 1 kHz en un disco duro utilizando el software LabChart (v8.0 o 8.1.16; ADInstruments). La PAM y la FC se calcularon post hoc latido a latido y se volvieron a muestrear a 1 kHz. La vista aérea del experimento con ratas conscientes se capturó en video continuamente con una cámara web HD (C920; Logicool) conectada a una computadora, y los datos de video se almacenaron a una velocidad de 10 fotogramas por segundo (fps).

En experimentos optogenéticos realizados en ratas anestesiadas o descerebradas, los valores iniciales se obtuvieron a partir de promedios de 15, 30 o 60 segundos antes de las intervenciones optogenéticas. También se determinaron los valores promedio de 1 s inmediatamente antes de cada período corto (0,5 s) de fostimulación durante el protocolo de estimulación intermitente de 1 min para examinar las respuestas de RSNA y VRNA a la fotoestimulación. En experimentos para estudiar los efectos de la estimulación optogenética mediante la activación de ChR2 en ratas conscientes, los valores iniciales se obtuvieron a partir de promedios de 15 s antes del inicio de la iluminación láser. En experimentos para estudiar el efecto de la inhibición optogenética mediante la activación de iChloC en ratas conscientes, se determinaron como línea de base los valores medios durante el período de 2 segundos inmediatamente antes de la iluminación láser. Los valores de referencia se presentan en las tablas complementarias 1 a 14.

Para cuantificar las respuestas de RSNA y VRNA a la fotoestimulación, después de obtener señales rectificadas de onda completa de estas actividades nerviosas periféricas, así como señales de ruido de fondo, se restó el componente de ruido para RSNA o VRNA de la señal rectificada. Las respuestas de RSNA y VRNA a las intervenciones optogenéticas se cuantificaron como cambios relativos con respecto a los valores iniciales, que se indicaron como 100%. Se realizaron procedimientos adicionales, es decir, análisis de superposición y promedio, para cuantificar RSNA y VRNA en respuesta a un período de fotoestimulación de 0,5 s durante un protocolo de estimulación intermitente de 1 min. Los cambios relativos en RSNA o VRNA desde la línea de base se volvieron a muestrear a 1 kHz en respuesta a cada período de fotoestimulación de 0,5 s, antes de superponerse entre sí y promediarse en el momento (Fig. 2c). Los valores de AUC de los cambios de RSNA promediados también se calcularon como un índice de las respuestas de RSNA a la fotoestimulación integrando los aumentos en los cambios de RSNA desde el valor inicial durante el período de tiempo posterior al análisis de superposición y promediado (Fig. 2c).

Se grabaron vídeos a 10 fps durante experimentos para estudiar el efecto de la estimulación optogenética en ratas conscientes; estos fueron analizados para calcular la velocidad locomotora mediante un sistema de seguimiento por video de acuerdo con su manual (SMART ver. 3.0; Panlab). Para determinar el contorno de la rata en cada imagen de una secuencia de vídeo, se utilizó como referencia una imagen del área experimental (pista circular) sin rata y se comparó con cualquiera de las imágenes de vídeo durante el experimento que contenían la rata. El sistema detectó entonces la diferencia entre ambas imágenes. Al detectar consecutivamente el centro de masa de la rata en cada imagen, se logró un seguimiento del movimiento de más de 200 ms. Posteriormente, se calculó la velocidad instantánea de la rata en la pista circular sin suavizar. Se utilizaron vídeos grabados durante experimentos para estudiar el efecto de la inhibición optogenética en ratas conscientes para validar los valores de WRR calculados mediante el método descrito anteriormente.

Los datos se excluyeron de los resultados en los casos en que las inyecciones no alcanzaron la región objetivo, las puntas de las fibras ópticas estaban ubicadas de manera inadecuada, se produjo una desconexión de las señales de telemetría durante la estimulación optogenética durante más de 1 segundo o las ratas no estaban dispuestas a correr voluntariamente en la rueda.

Todas las mediciones se exportaron en Excel (Microsoft). Todos los análisis estadísticos se realizaron en SigmaPlot 14.0 (Systat Software, Inc). Para las comparaciones entre grupos independientes, los datos se analizaron mediante la prueba t de Welch si estaban distribuidos normalmente (evaluados mediante la prueba de Shapiro-Wilk) o mediante una prueba U de Mann-Whitney si no estaban distribuidos normalmente. Para muestras pareadas entre ensayos, los datos se analizaron mediante pruebas t pareadas. Para muestras repetidas entre ensayos o cambios en el curso del tiempo, los datos se analizaron mediante ANOVA de medidas repetidas unidireccionales (ANOVA RM) o ANOVA RM unidireccional de Friedman por rango donde se suponían supuestos de normalidad (prueba de Shapiro-Wilk) y/o varianza igual ( Prueba de Brown-Forsythe) no se cumplieron en ANOVA. Para muestras repetidas entre ensayos entre grupos independientes, los datos se analizaron mediante RM ANOVA de dos vías. Si correspondía, estos procedimientos ANOVA fueron seguidos por la prueba post hoc de Dunnett, Holm-Sidak o Tukey. Todas las pruebas fueron bilaterales. Las pruebas utilizadas para presentar cada gráfico en figuras y otra información estadística, incluidos los valores estadísticos F/t/χ2 y los grados de libertad, se presentan en la Tabla complementaria 15. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos se expresan como medias con errores estándar (SEM).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Todos los datos asociados con este estudio se proporcionan en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Todo el código utilizado para analizar las respuestas simpáticas y cardiovasculares está disponible en OSF: https://osf.io/tuhgm/.

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Esta investigación fue apoyada por una subvención JSPS KAKENHI para investigación científica (B) (21H03321) (SK); una subvención JSPS KAKENHI para investigación científica (B) (18H03151) (SK); una subvención JSPS KAKENHI para jóvenes científicos (A) (15H05367) (SK); una subvención JSPS KAKENHI para investigaciones desafiantes (exploratorias) (20K21759) (SK); una subvención JSPS KAKENHI para investigación científica (C) (22K06470) (N.Ka.); una subvención JSPS KAKENHI para investigación científica (C) (19K06954) (N.Ka.); una subvención JSPS KAKENHI para investigación científica (B) (20H03418) (KN); por AMED (JP21wm0525002 a N.Ka.; JP21gm5010002 a KN); por JST Moonshot R&D (JPMJMS2023 a KN); y subvenciones de la Takeda Science Foundation (SK). Agradecemos a Yui Yamane, Koji Maruyama, Atsuki Otake, Yumi Ono y Eri Hanai por su ayuda con los experimentos y el conteo celular manual doble ciego, así como a Tottori Bio Frontier administrado por la prefectura de Tottori, Japón, por el uso de la microscopía confocal. sistema.

División de Fisiología Integrativa, Facultad de Medicina de la Universidad de Tottori, Yonago, Japón

Satoshi Koba, Nao Kumada, Emi Narai y Tatsuo Watanabe

División de Biociencia Integrativa, Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Tottori, Yonago, Japón

kumada también

Departamento de Fisiología Integrativa, Facultad de Medicina de la Universidad de Nagoya, Nagoya, Japón

Naoya Kataoka y Kazuhiro Nakamura

Instituto Universitario de Investigación Avanzada de Nagoya, Nagoya, Japón

Naoya Kataoka

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SK concibió el estudio. SK y N.Ku diseñaron experimentos con aportaciones de N.Ka. y KNSK, N.Ka., KN y TW prepararon materiales de estudio. n.ku. y SK realizó experimentos y analizó datos. SK, N.Ku. y EN prepararon cifras. SK, N.Ku. y KN analizaron los datos. SK y KN escribieron el manuscrito con aportaciones de todos los coautores.

Correspondencia a Satoshi Koba.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Koba, S., Kumada, N., Narai, E. et al. Una vía excitatoria monosináptica del tronco encefálico que impulsa las actividades locomotoras y las respuestas cardiovasculares simpáticas. Nat Comuna 13, 5079 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32823-x

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Recibido: 10 de septiembre de 2021

Aceptado: 18 de agosto de 2022

Publicado: 29 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32823-x

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Investigación Clínica Autonómica (2022)

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